عزل الحمض النووي الريبي البكتيري المستهدف المرتبط بالحمض النووي الريبي التنظيمي الصغير باستخدام تنقية التقارب

خذ محللة خلية بكتيرية تحتوي على مكونات خلوية ، بما في ذلك الحمض النووي الريبي المرسال الموسومة MS2 المرتبط بالحمض النووي الريبي المستهدف.

الحمض النووي الريبي المسموم بعلامة MS2 هو حمض مضمض رمسال تنظيمي صغير مصمم هندسيا يحمل حلقة جذعية MS2 aptamer في نهايته 5 ، والتي تظهر تقاربا عاليا مع بروتين الغلاف الفيروسي MS2.

انقل المحللة البكتيرية إلى عمود كروماتوغرافيا تقارب متوازن مسبقا يحتوي على راتنج الأميليوز المرتبط ببروتينات الاندماج المكونة من بروتين ربط المالتوز (MBP) وبروتين طبقة MS2.

يلتقط بروتين طبقة MS2 الثابت على وجه التحديد الحلقة الجذعية للأبتامر ل sRNA الموسوم بعلامة MS2 ، مع الاحتفاظ بالرنا المرسال المستهدف السليم المرتبط بالحمض النووي الريبي.

يتم جمع الجزيئات غير الموسومة التي تظل غير مرتبطة في التدفق.

اغسل العمود بمخزن مؤقت لإزالة الجزيئات المتبقية غير المرتبطة.

Elute مع مخزن مؤقت يحتوي على المالتوز ، والذي يزيح MBP من الراتنج ، مما يطلق الحمض النووي الريبي المسموق بعلامة MS2 المرتبط بالحمض النووي الريبي المستهدف.

اجمع الكسور وخزنها على الجليد للحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي لتحليلها في اتجاه المصب.

قم بإزالة طرف العمود ، ثم ضع عمودا كروماتوغرافيا في رف عمود واغسل العمود بالماء فائق النقاء. أضف 300 ميكرولتر من راتنج الأميليوز واغسل العمود ب 10 مل من العازلة A.خفف 1 ، 200 بيكامول من بروتين MBP-MS2 في ستة ملليلتر من المخزن المؤقت A وقم بتحميله في العمود.

اغسل العمود ب 10 ملليلتر من المخزن المؤقت A.Next ، قم بإجراء تنقية MS2-affinity. قم بتحميل محللة الخلية في العمود واجمع جزء التدفق في أنبوب تجميع نظيف. اغسل العمود ثلاث مرات باستخدام 10 ملليلتر من المخزن المؤقت A واجمع جزء الغسيل ، ثم قم بمسح العمود بملليلتر واحد من المخزن المؤقت E واجمع جزء الشطف في أنبوب دقيق سعة ملليلتر.

احتفظ بجميع الكسور المجمعة على الجليد حتى استخراج الحمض النووي الريبي.