التصور بوساطة الجسيمات النانوية لإعادة تشكيل الليزوزومات الداخلية في الخلايا المصابة بالبكتيريا

خذ شريحة ذات حجرة تحتوي على خلايا ظهارية بشرية مع جسيمات داخلية تحمل علامة فلورسنت.

إدخال البكتيريا المسببة للأمراض داخل الخلايا واحتضانها ، مما يسمح لها بالالتصاق بالخلايا.

تقوم

البكتيريا بحقن البروتينات التي تعيد تنظيم الهيكل الخلوي للمضيف ، وتشكل نتوءات غشائية تستوعب البكتيريا في فجوات.

تعمل هذه الفجوات على تمديد الإسقاطات الأنبوبية المتصلة بالنظام الليزوزومي الداخلي ، وهي شبكة من الحويصلات والعضيات التي تنظم الاتجار داخل الخلايا.

تعيد هذه الإسقاطات توجيه نقل الحويصلة وإعادة تشكيل النظام المحلل الداخلي.

اغسل لإزالة البكتيريا خارج الخلية ، ثم احتضنه بوسط يحتوي على المضادات الحيوية للقضاء على أي بكتيريا متبقية.

استبدلها بوسيط تصوير خال من المصل يحتوي على المضاد الحيوي ، وأضف الجسيمات النانوية المصنفة بفلوروفور متباين.

احتضان للسماح بدخول الجسيمات النانوية عن طريق الالتقام الخلوي والتراكم في الحويصلات المعاد تشكيلها.

يغسل لإزالة الجسيمات النانوية غير الداخلية ، ثم يحتضن في وسط تصوير مكمل بالمصل.

تتيح الجسيمات النانوية الفلورية والجسيمات الداخلية المسماة تصور إعادة تشكيل الأحزمات الليزوزومية الداخلية التي تسببها البكتيريا.

لبدء هذا الإجراء ، قم بقياس OD 600 من البكتيريا المزروعة الفرعية وتخفيفها إلى OD 600 من 0.2 في مليلتر واحد من PBS ، وأضف كميات مناسبة من البكتيريا إلى خلايا HeLa في شريحة غرفة الآبار 8 لتحقيق تعدد العدوى 100. احتضن لمدة 30 دقيقة في حاضنة الخلية.

اغسل خلايا HeLa ثلاث مرات باستخدام PBS لإزالة البكتيريا غير الداخلية. يتم تعيين هذه النقطة الزمنية على أنها صفر ساعة بعد الإصابة أو صفر ساعة في السنة. أضف 300 ميكرولتر من وسط الاستزراع الطازج الذي يحتوي على 100 ميكروغرام لكل ملليلتر من الجنتاميسين إلى الخلايا واحتفظ به لمدة ساعة واحدة.

بعد ساعة واحدة ، استبدل الوسط بوسيط تصوير يحتوي على 10 ميكروغرام لكل مليلتر من الجنتاميسين. أضف NPs الذهبية BSA-rhodamine إلى خلايا HeLa للحصول على تركيز نهائي من OD 520 من 0.1.

احتضن لمدة ساعة. بعد ساعة واحدة ، قم بإزالة الوسيط واغسله ثلاث مرات باستخدام PBS. أخيرا ، أضف 300 ميكرولتر من وسيط التصوير الطازج الذي يحتوي على 10 بالمائة FCS و 10 ميكروغرام لكل مليلتر من الجنتاميسين لبقية وقت الحضانة.