عزل الحويصلات خارج الخلية المحتوية على سيدروفور من المتفطرة السلية

خذ مزرعة المتفطرة السلية المزروعة في وسط يحد من الحديد لتعزيز إفراز الحويصلات خارج الخلية التي تحتوي على سيدروفورات ، مخلب حديد.

جهاز طرد مركزي لحبيبات البكتيريا.

اجمع المادة الطافية وقم بتصفيتها لإزالة البكتيريا المتبقية.

انقل المرشح إلى نظام الترشيح الفائق المقلوب والفلتر لإزالة الوسائط الزائدة وتركيز المركبات الكهربائية.

الطرد المركزي المركز لحبيبات الحطام الخلوي.

انقل المادة الطافية إلى أنبوب الطرد المركزي الفائق وجهاز الطرد المركزي لتجميع حبيبات EV.

تخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق الحبيبات في مخزن مؤقت ، واخلطها مع وسط تدرج كثافة مركز لتشكيل الطبقة السفلية.

تراكب مع تركيزات متناقصة لوسط التدرج لإنشاء تدرج كثافة متقطع.

أضف المخزن المؤقت في الأعلى وجهاز الطرد المركزي. تهاجر المركبات الكهربائية إلى الطبقة التي تتناسب مع كثافتها الطفوية.

اجمع كل جزء في أنبوب منفصل.

الجزء المنقى مع المركبات الكهربائية المحتوية على siderophore جاهز للدراسات النهائية.

انقل المزرعة إلى خمسة أنابيب طرد مركزي مخروطية سعة 225 مليلتر وأجهزة طرد مركزي عند 2,850 مرة جم لمدة سبع دقائق عند 20 درجة مئوية. اجمع المادة الطافية المزرعة باستخدام ماصة 50 مل وقم بتعقيمها من خلال مرشح 0.22 ميكرون.

لعزل MEVs ، انقل ترشيح المزرعة إلى نظام ترشيح فائق للخلية المقلوبة يوضع عند أربع درجات مئوية وقم بتصفية التركيز عند ضغط أقل من 50 رطل لكل بوصة مربعة من خلال غشاء قطع 100 كيلو دالتون. ثم قم بالطرد المركزي لترشيح المزرعة المركزة عند 15,000 مرة جم لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية واجمع المادة الطافية في أنابيب الطرد المركزي الفائقة المصنوعة من البولي كربونات. قم بالطرد المركزي للمادة الطافية عند 100,000 مرة جم لمدة ساعتين عند أربع درجات مئوية.

بعد ذلك ، قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق الكريات الغشائية بإجمالي مليلتر واحد من PBS المعقمة عن طريق السحب اللطيف. امزج 0.5 مل من تعليق الحبيبات مع 1.5 مل من محلول اليوديكسانول بنسبة 60٪ في الجزء السفلي من أنبوب الطرد المركزي الفائق ذو الجدران الرقيقة من مادة البولي بروبلين. قم بتراكب تعليق اليوديكسانول 45٪ MEV مع مليلتر واحد من محاليل اليوديكسانول بنسبة 40٪ و 35٪ و 30٪ و 25٪ و 20٪ ومليلتر واحد من PBS في الأعلى.

جهاز طرد مركزي عند 100,000 مرة جم لمدة 18 ساعة عند أربع درجات مئوية. بعد ذلك ، استخدم حقنة هاميلتون سعة ملليلتر واحد لتجميع كسور التدرج ذات الكثافة الواحدة التي تبدأ من الأعلى. قم بتخفيف كل جزء تم جمعه إلى 20 مليلترا باستخدام PBS وجهاز الطرد المركزي عند 100,000 مرة جم لمدة ساعتين عند أربع درجات مئوية.

قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليقها في 0.5 مل من PBS.