عزل وإثراء الحويصلات خارج الخلية المشتقة من الغشاء الخارجي من البكتيريا
JoVE Encyclopedia of Experiments
علم الأحياء الدقيقة
0 مشاهدات • 3:53 د • September 26th, 2025
ابدأ بتلقيح مستعمرة من البكتيريا المعدلة وراثيا في وسط سائل.
تعبر هذه البكتيريا عن بروتين اندماج فلوري في الغشاء الخارجي ، وهي طبقة واقية خارجية.
احتضان للبكتيريا لإطلاق الحويصلات خارج الخلية (EVs) ، وهي هياكل نانوية مرتبطة بالغشاء تشارك في الاتصال بين الخلايا ، والتي تتضمن بروتين الفلورسنت.
انقل المزرعة إلى زجاجة وجهاز طرد مركزي بسرعة منخفضة لتكوير الخلايا.
انقل المادة الطافية التي تحتوي على المركبات الكهربائية والبروتينات الخلوية وحطام الخلايا. جهاز طرد مركزي بسرعة عالية ، وإزالة المادة الطافية التي تحتوي على الحطام.
قم بتصفية المادة الطافية من خلال غشاء للتخلص من أي بكتيريا وحطام متبقية.
تلقيح عينة على أجار واحتضانها. يؤكد عدم تكوين المستعمرة البكتيرية عدم وجود البكتيريا.
انقل المحلول إلى جهاز ترشيح فائق مع غشاء شبه نافذ وجهاز طرد مركزي لاحتجاز المركبات الكهربائية مع التخلص من البروتينات الأصغر.
اجمع المركبات الكهربائية المركزة في أنبوب لتحليلها النهائي.
ابدأ بتلقيح مستعمرات مفردة من الإشريكية القولونية في 250 إلى 1000 مل من Luria-Bertani ، أو مرق LB ، باستخدام حلقة معقمة. ثم احتضن المزرعة هوائية في حاضنة اهتزاز بمعدل 300 دورة في الدقيقة و 37 درجة مئوية. بعد 48 ساعة من الحضانة، قم بتوضيح وسط الاستزراع البكتيري عن طريق نقل مزارع الخلايا لتنظيف زجاجات الطرد المركزي المصنوعة من البولي بروبلين سعة 500 مل إلى أجهزة الطرد المركزي في دوار ذو زاوية ثابتة ذات سعة كبيرة عند أربع درجات مئوية و 5,000 مرة G لمدة 15 دقيقة.
انقل المادة الطافية لتنظيف زجاجات أجهزة الطرد المركزي عن طريق سكبها بعناية في جهاز الطرد المركزي عند 10,000 مرة جم لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك ، قم بنقل المادة الطافية إلى جهاز مرشح يعمل بالفراغ من البولي إيثر سلفون بحجم مناسب بحجم مناسب وقم بتوصيل جهاز الترشيح بمصدر جدار مفرغ. إذا انخفض معدل الترشيح بشكل كبير ، فقم بنقل المادة غير المصفاة إلى جهاز جديد.
يمكن تخزين الوسط المفلتر عند أربع درجات مئوية طوال الليل أو يمكن معالجته على الفور. للتحقق من الإزالة الكاملة للخلايا القابلة للحياة ، انشر جزءا من المادة الطافية المفلترة على ألواح أجار مناسبة وتأكد من عدم وجود أي مستعمرات بعد الحضانة في الظروف المثلى للسلالة البكتيرية. لتركيز الوسط المفلتر بحجم 100 ملليلتر ، قم بتحميل 90 مل من وسط الاستزراع المفلتر على خزان جهاز الترشيح الفائق بالطرد المركزي مع قطع الوزن الجزيئي 100 كيلو دالتون وقم بالطرد المركزي للوسط في دوار الجرافة المتأرجح عند أربع درجات مئوية و 2,000 مرة G لمدة 15 إلى 30 دقيقة حتى يتركز حجم الوسط في الخزان العلوي إلى أقل من 0.5 ملليلتر.
لتعبئة الخزان بأي وسيط ثقافة مفلتر متبقى ، قم بإزالة التدفق في الجزء السفلي من الجهاز لإعادة التوازن. إذا زادت لزوجة الوسط المركز في الخزان بشكل واضح ، فقم بتخفيف الوسط باستخدام PBS وأعد التركيز عن طريق الطرد المركزي لتقليل أي حويصة غير خلوية ، أو بروتينات EV ، أصغر من قطع الوزن الجزيئي البالغ 100 كيلو دالتون. بعد ذلك ، انقل الوسط المركز إلى أنبوب ربط منخفض البروتين لتخزينه عند أربع درجات مئوية طوال الليل.
نظرة عامة
تصف هذه المقالة طريقة لعزل الحويصلات خارج الخلوية (EVs) من بكتيريا مهندسة وراثياً تعبر عن بروتين اندماجي فلوري. تتضمن العملية عدة خطوات من الطرد المركزي والترشيح لضمان إزالة الخلايا الحية وتركيز الحويصلات خارج الخلوية من أجل التحليلات اللاحقة.
المكونات الرئيسية للدراسة
مجال العلم
- علم الأحياء الدقيقة
- بيولوجيا الخلية
- التكنولوجيا الحيوية
خلفية علمية
- تلعب الحويصلات خارج الخلوية دوراً حاسماً في التواصل بين الخلايا.
- يمكن استخدام البكتيريا المعدلة وراثياً لإنتاج البروتينات الفلورية.
- يعد عزل الحويصلات خارج الخلوية أمراً ضرورياً لدراسة وظائفها وتطبيقاتها.
- تتضمن الطرق القياسية تقنيات الطرد المركزي والترشيح.
الغرض من الدراسة
- تطوير طريقة موثوقة لفصل الحويصلات خارج الخلوية (EVs) من المزارع البكتيرية.
- ضمان إزالة البكتيريا الحية أثناء عملية الفصل.
- تركيز الحويصلات خارج الخلوية (EVs) لإجراء المزيد من التحاليل.
الطرق المستخدمة
- تلقيح البكتيريا المعدلة وراثياً في وسط سائل.
- التحضين للسماح بتحرر الحويصلات خارج الخلوية (EV).
- الطرد المركزي لفصل الخلايا والمخلفات عن الراشح.
- الترشيح للتخلص من البكتيريا المتبقية وتركيز الحويصلات خارج الخلوية (EVs).
النتائج الرئيسية
- تم تأكيد العزل الناجح للحويصلات خارج الخلية (EVs) من خلال غياب المستعمرات البكتيرية.
- تم تحقيق تركيز الحويصلات خارج الخلية (EVs) باستخدام تقنيات الترشيح الفائق.
- تم التحقق من دمج البروتينات الفلورية داخل الحويصلات خارج الخلية (EVs).
- أثبتت الطريقة كفاءتها في معالجة أحجام كبيرة من الوسط الزرعي.
الاستنتاجات
- تعد الطريقة الموصوفة فعالة لعزل الحويصلات خارج الخلوية (EVs) من المزارع البكتيرية.
- تضمن إزالة الخلايا الحية، مما يجعلها مناسبة للتطبيقات اللاحقة.
- توفر أساساً لمزيد من الدراسات حول وظائف الحويصلات خارج الخلوية (EVs) وتطبيقاتها.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
يتيح عزل الحويصلات خارج الخلوية (EVs) البكتيرية تقليل المخاطر الميكانيكية في مراحل الاكتشاف المبكرة من خلال توفير مصدر قابل للتوسع للجسيمات النانوية المشتقة من الغشاء للتحقق من الأهداف والفحص المظهري. وتدعم هذه الطريقة تطوير المقايسات من خلال إثراء معياري وقابل للتكرار للحويصلات خارج الخلوية، مما يقلل من التباين في التحليلات الوظيفية اللاحقة. وهذا يجعل هذه التقنية أداة انتقالية لتقييم العلاجات المشتقة من البكتيريا أو اللقاحات المرشحة بثقة تنبؤية محسنة.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: تمكّن من استقصاء الحويصلات المشتقة من الغشاء البكتيري كعوامل محتملة لتعديل المناعة أو كأنظمة لإيصال المستضدات.
- القيمة التشغيلية: توفر مصدراً ثابتاً من الحويصلات خارج الخلوية (EV) للفحص الوظيفي للتفاعلات بين المضيف والممرض.
- القيمة التنبؤية: تدعم الحد من المخاطر الآلية من خلال عزل الحويصلات خارج الخلوية (EVs) ذات علامات سطحية محددة لدراسات ارتباط الهدف.
الفحص وتطوير المقايسة
- القيمة العلمية: يوفر تحضيرات معيارية من الحويصلات خارج الخلوية (EV) للفحص عالي الإنتاجية لامتصاص الحويصلات البكتيرية أو التنشيط المناعي.
- القيمة التشغيلية: يضمن إزالة الخلايا الحية والبقايا، مما يحسن من خصوصية المقايسة ويقلل من الإشارات الخاطئة.
- القابلية للتوسع: يتيح التركيز عن طريق الترشيح الفائق معالجة أحجام كبيرة من المزارع الخلوية لضمان الجاهزية لحملات الفحص.
الأبحاث الترجمية وما قبل السريرية
- الاستمرارية الانتقالية: تحافظ الحويصلات خارج الخلوية (EVs) المركزة على الوسم الفلوري لتتبع التوزع الحيوي في النماذج قبل السريرية.
- الحد من المخاطر الآلية: تسمح الحويصلات خارج الخلوية (EVs) المعزولة بتقييم المسارات التي تتوسطها الحويصلات البكتيرية دون تأثيرات مضللة ناتجة عن البكتيريا الحية.
- أهمية النماذج قبل السريرية: تدعم تحليل الاستجابة للجرعة في نماذج العدوى أو الالتهاب باستخدام مدخلات معيارية من الحويصلات خارج الخلوية (EVs).
تكامل مسار العمل وسير العمل
تندرج هذه الطريقة ضمن تسلسل عمليات الاكتشاف، بدءاً من التحقق الأولي من الهدف وصولاً إلى تحديد المركبات الرائدة، حيث تعمل الحويصلات خارج الخلوية (EVs) البكتيرية كمجسات ميكانيكية أو ناقلات توصيل. وهي تتيح سير عمل عمليات الفحص من خلال توفير أجزاء منقاة وقابلة للقياس الكمي من الحويصلات خارج الخلوية للقراءات الوظيفية. كما تدعم هذه العملية التحليلات من خلال الكشف الفلوري أو الكيميائي الحيوي عن الحويصلات خارج الخلوية المُكثفة، مما يسهل التحليل المقارن عبر ظروف مختلفة. كما يدعم البروتوكول إمكانية إعادة الاستخدام على المستوى المؤسسي بفضل قابليته للتوسع وتوحيده عبر السلالات البكتيرية المختلفة.
- بيولوجيا الاكتشاف: تدعم اختبار الفرضيات حول أدوار الحويصلات البكتيرية في الإشارات بين الخلايا والتعديل المناعي.
- الفحص: توفر تحضيرات من الحويصلات خارج الخلوية (EV) خالية من الشوائب لإجراء فحص موثوق للمركبات أو الأنماط الجينية.
- التحليلات: تتيح القياس الكمي لعائد الحويصلات خارج الخلوية والإشارة الفلورية لأغراض التقييس.
- الأبحاث الانتقالية: تربط عملية عزل الحويصلات خارج الخلوية بالتقييم قبل السريري للعلاجات القائمة على الحويصلات البكتيرية.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: تؤسس منصة قابلة لإعادة الاستخدام لإنتاج الحويصلات خارج الخلوية عبر مشاريع متعددة في الهندسة البكتيرية.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تزيد من الثقة في التحقق من الأهداف من خلال القضاء على التلوث البكتيري في تحضيرات الحويصلات خارج الخلوية (EV).
- القيمة التشغيلية: توحد عملية العزل عبر الطرد المركزي المتسلسل والترشيح، مما يحسن الاتساق بين الدفعات الإنتاجية.
- القيمة الاستراتيجية: تقلل من نتائج الفحص الإيجابية الكاذبة، مما يحسن كفاءة اتخاذ قرارات المضي قدماً أو التوقف في مراحل الاكتشاف المبكرة.
- التأثير على المحفظة: تتيح تحديد الأولويات المعدلة حسب المخاطر للمرشحين القائمين على الحويصلات البكتيرية من خلال الحصول على الحويصلات خارج الخلوية (EV) بطريقة قابلة للتكرار.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في التعامل مع المزارع البكتيرية والتقنيات المعقمة للحفاظ على سلامة الحويصلات خارج الخلوية (EV).
- يعتمد على توفر أجهزة طرد مركزي قادرة على الوصول إلى 5,000×g و 10,000×g، ووحدات ترشيح بالتفريغ، وأجهزة ترشيح فائق بحد قطع 100 kDa.
- يستلزم توحيد خطوات الترشيح والترشيح الفائق بين الفرق لضمان استعادة متسقة للحويصلات خارج الخلوية (EV).
- تشمل اعتبارات التكييف ضبط أوقات الطرد المركزي أو أحجام المرشحات لتناسب الأنواع البكتيرية المختلفة أو أحجام الحويصلات خارج الخلوية (EV) المختلفة.
- قيد عملي: قد يختلف عائد الحويصلات خارج الخلوية (EV) باختلاف مرحلة النمو البكتيري وكفاءة الحث، مما يتطلب تحسين العملية لكل سلالة.
الأسئلة الشائعة حول الصناعات الدوائية الحيوية
العزلة وتوصيف الحويصلات خارج الخلية التي تنتجها الحديد-المحدودة المتفطره
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
حجم استبعاد الكروماتوغرافيا لتحليل الغشاء الخارجي البكتيري فيسيكلي التجانس
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
عزل وتوصيف الحويصلات خارج الخلية البكتيرية الزرقاء
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
عزل الحويصلات خارج الخلية المحتوية على سيدروفور من المتفطرة السلية
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
عزل الحويصلات البكتيرية خارج الخلية باستخدام كروماتوغرافيا استبعاد الحجم
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
Separation and Enrichment of Extracellular Vesicles in the Presence of Virions
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
فصل الكروماتوغرافيا القائم على استبعاد الحجم للحويصلات البكتيرية خارج الخلية: تقنية لفصل السكان غير المتجانسين لحويصلات الغشاء الخارجي البكتيرية سالبة الجرام بناء على حجمها
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
تنقية عالية الغلة الاستعدادات الحويصلة خارج الخلية بعيدا عن الفيروس
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
عزل وتنقية الحويصلات خارج الخلية من الإشريكية القولونية والبكتيريا الأخرى قابلة للتطوير
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
المتفطرة السلية إثراء الحويصلات خارج الخلية من خلال كروماتوغرافيا استبعاد الحجم
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
آخر تحديث: 29 أغسطس 2026