قياس الأميلويد البكتيرية الناجمة عن العدوى باستخدام مضان ثيوفلافين تي

خذ كوفيت يحتوي على محلول عملي من ثيوفلافين تي ، وهي صبغة فلورية خاصة بالأميلويد ، مذابة في محلول ملحي مخزن بالفوسفات.

ضع الكوفيت في مقياس الطيف الفلوري وسجل إشارة التألق الأساسية.

أوقف المسح مؤقتا وقم بإزالة الكوفيت.

أضف المادة الطافية المعقمة بالمرشح التي تم جمعها من الخلايا البطانية الرئوية المصابة ببكتيريا الزائفة الخبيثة.

يحتوي المادة الطافية على مجاميع الأميلويد ، وهي بروتينات غنية بصفائح بيتا غير مطوية بشكل خاطئ.

امزج المحتويات برفق عن طريق الانعكاس لضمان توزيع موحد.

أعد تحميل الكوفيت في مقياس الطيف الفلوري واستأنف المسح للحصول على إشارة مضان قائمة على الوقت.

يرتبط Thioflavin T على وجه التحديد بالأميلويدات الغنية بصفائح بيتا ، مما يؤدي إلى تعزيز التألق.

قم بإجراء فحص مضان باستخدام نفس الإعدادات.

تشير الزيادة في التألق بالنسبة لخط الأساس إلى وجود ووفرة نسبية للأميلويدات التي يسببها العدوى في المادة الطافية للثقافة.

لتحديد كمية الأميلويدات داخل المادة الطافية ، أضف 20 ميكرولتر من محلول مخزون 50X thioflavin T المحضر حديثا والمصفى إلى مليلتر واحد من PBS في كوفيت مقياس الطيف الضوئي بملليلتر واحد ، وقم بتحميل العينة المخففة على مقياس الطيف الفلوري.

قم بقياس انبعاث التألق الأساسي باستخدام إثارة 425 نانومتر. مسح انبعاث التألق من 450 إلى 575 نانومتر بزيادتين نانومتر. ثم اضبط الجهاز لإجراء مسح بفاصل زمني باستخدام إثارة 425 نانومتر وانبعاث 482 نانومتر مع الحصول على البيانات كل 0.2 ثانية لمدة 60 ثانية.

أوقف المسح مؤقتا بعد 20 ثانية وأضف 10 ميكرولتر من المادة الطافية المعقمة بالفلتر إلى الكوفيت. بعد الخلط عن طريق الانعكاس، أعد تحميل الكوفيت على مقياس الطيف الفلوري واستأنف المسح المستند إلى الوقت لمدة 40 ثانية الأخيرة. عند الانتهاء من الفاصل الزمني، قم بإجراء مسح طيف انبعاثات التألق النهائي باستخدام إعدادات المسح الأصلي.