موسوعة JoVE للتجارب
علم الأحياء الدقيقة
0 مشاهدة • 2:27 دقيقة • September 26th, 2025
ابدأ بمزرعة Pseudomonas aeruginosa المؤتلف في وسط اختيار المضادات الحيوية.
تحتوي هذه البكتيريا على بلازميد غير متكرر مدمج في الجينوم بالقرب من الجين المستهدف البكتيري المخصص للحذف.
حدث التكامل عبر تسلسلات متجانسة مشتركة بين البلازميد والجينوم ، مما أدى إلى إعادة تركيب متقاطع واحد.
يشفر البلازميد جين مقاومة المضادات الحيوية وجين sacB ، الذي يمنح حساسية السكروز.
ضع البكتيريا على وسط يحتوي على السكروز ولكنه يفتقر إلى المضاد الحيوي واحتضن.
بدون ضغط المضادات الحيوية ، يحدث إعادة تركيب ثان ، أو تقاطع مزدوج ، بين المناطق المتجانسة ، مما يؤدي إلى استئصال البلازميد والجين المستهدف.
أثناء التكاثر البكتيري ، لا ينتقل البلازميد المستأصل ، مما يجعل البكتيريا تتحمل السكروز.
قم بتصحيح البكتيريا على وسط غير انتقائي ووسط يحتوي على السكروز أو المضاد الحيوي ، واحتضنها.
يؤكد النمو على الوسائط غير الانتقائية والسكروز ، ولكن ليس على وسط المضادات الحيوية ، نجاحا في التقاطع المزدوج.
ابدأ بزراعة المستعمرات المؤتلفة في مرق عزل الزائفة ، أو PIB. قم بتلقيح وخط 10 ميكرولتر من كل مزرعة على ألواح PIA دافئة مسبقا ، مع استكمال 10٪ من السكروز. ثم احتضن الأطباق طوال الليل عند 37 درجة مئوية.
في اليوم التالي ، قم بإزالة الألواح من الحاضنة وفحصها للنمو. يجب أن تكون المستعمرة المقاومة للسكروز مؤلفة مزدوجة كروس. استخدم أعواد أسنان معقمة للصق ما لا يقل عن 20 مستعمرة على ألواح PIA مسخنة مسبقا ، و PIA المكملة بنسبة 10٪ من السكروز ، و PIA المكملة بالكاربينيسيلين.
احتضن الألواح طوال الليل وفحصها للنمو في اليوم التالي. المؤتلفات المتقاطعات المزدوجة الحقيقية ستكون حساسة للكاربينيسيلين ومقاومة للسكروز.