JoVE Encyclopedia of Experiments
علم الأحياء الدقيقة
0 مشاهدات • 5:46 د • September 26th, 2025
خذ صفيحة موائع دقيقة بها بئر تحتوي على جراثيم من Streptomyces venezuelae ، وهي بكتيريا مكونة للخيوط.
تحتوي الآبار المعينة الأخرى إما على وسط غني بالمغذيات أو متوسط مستهلك.
تشتق الجراثيم من سلالة تعبر عن بروتينات DivIVA و FtsZ الفلورية ، والتي تتشكل في أطراف الخيط والجدران المتقاطعة ، على التوالي.
ضع زيت الغمر على العدسة الشيئية للمجهر المقلوب وعلى نافذة تصوير اللوحة.
قم بتركيب اللوحة على مرحلة المجهر وابدأ التصوير بفاصل زمني.
قم بتحميل الجراثيم في غرفة زراعة اللوحة.
بعد ذلك ، أدخل الوسط الغني بالمغذيات لبدء إنبات الأبواغ.
مع نمو الخيوط ، يتراكم DivIVA عند أطراف الخيوط ، بينما يشكل FtsZ حلقات متناثرة عند الجدران المتقاطعة.
بعد ذلك ، قم بالتبديل إلى الوسيط المستهلك. نقص العناصر الغذائية في هذا الوسط يدعم التبويض.
في الخيوط المنبتة ، تختفي بؤر DivIVA ، ويعيد FtsZ التنظيم في سلم منتظم من حلقات التقسيم ، مكونا حواجز الأبواغ.
بمرور الوقت ، يؤكد اختفاء مضان FtsZ في نفس الخيوط اكتمال الأبواغ.
قم بتسخين الغرفة البيئية مسبقا إلى 30 درجة مئوية مقدما.
ثم قم بتشغيل المجهر وبرنامج التحكم في المجهر. ضع هدفا عاليا لغمر الزيت بفتحة عدسة عددية عالية في مكانه وتأكد من أن المرشحات المناسبة والمرايا التخطيطية التي تم تعيينها للحصول على صور تباين التداخل التفاضلي ، جنبا إلى جنب مع صور اندماج الفلورسنت الأصفر والبروتين الفلوري الأحمر في مكانها. ضع قطرة من زيت الغمر في الهدف وفي أسفل نافذة التصوير على لوحة الموائع الدقيقة أيضا.
قم بتركيب جهاز الموائع الدقيقة المختوم بعناية على مسرح المجهر المقلوب وثبته في مكانه. استخدم علامات الموضع المضمنة لتركيز نافذة التصوير لغرفة زراعة الموائع الدقيقة. ركز على الجزء الأيسر من غرفة التدفق الأولى المسماة A ، ثم انقل المرحلة إلى حجم المصيدة الخامس ، المقابل لارتفاع المصيدة البالغ 0.7 ميكرومتر.
في برنامج الموائع الدقيقة ، اضبط النظام على تحميل الخلايا من بئر المدخل ثمانية عند أربعة رطل لكل بوصة مربعة لمدة 15 ثانية. بعد تشغيل العملية ، تحقق من كثافة الخلايا في غرفة الاستزراع عن طريق تحريك المرحلة عبر نافذة التصوير. إذا لم يتم احتجاز جراثيم ، كرر خطوة تحميل الخلية أو بدلا من ذلك ، قم بزيادة ضغط التحميل و / أو الوقت حتى يتم تحقيق كثافة الخلية المطلوبة من واحد إلى 10 جراثيم لكل نافذة تصوير.
احرص على تجنب التحميل الزائد على غرفة الاستزراع. بعد ذلك ، ابدأ برنامج التدفق المعد مسبقا في برنامج التحكم واسمح للوحة الموائع الدقيقة بتسخين التوازن لمدة ساعة واحدة في مرحلة المجهر قبل البدء في الحصول على الصور. في برنامج التحكم في المجهر ، قم بإعداد اكتساب متعدد الأبعاد لالتقاط صور متعددة في مواضع مراحل متعددة بمرور الوقت عن طريق تحديد دليل أولا للحفظ التلقائي لملفات الصور.
بعد ذلك ، انتقل إلى إعدادات الإضاءة وأدخل إعدادات الإضاءة المثلى المحددة مسبقا لكل بناء محدد. ثم قم بإعداد سلسلة زمنية للحصول على صور كل 40 دقيقة لمدة 24 ساعة. من أجل تحديد مواضع المرحلة وضبط التركيز البؤري التلقائي ، امسح غرفة الثقافة وقم بتخزين مواضع المرحلة لكل موضع تصوير محل اهتمام.
تأكد من أن المواضع أحادية المرحلة متباعدة بما يكفي لتقليل تبييض الصور وسمية الصور. بمجرد التحقق من إحداثيات Z لمواضع المرحلة المحددة، قم بتنشيط التركيز البؤري التلقائي للأجهزة. ثم ابدأ تجربة الفاصل الزمني في برنامج التحكم في المجهر.
أوقف الحصول على الصورة بعد 24 إلى 30 ساعة ، أو عندما تتمايز الخيوط في المنطقة المعنية إلى جراثيم. ثم أوقف برنامج التدفق في البرنامج وقم بتفكيك جهاز الموائع الدقيقة. قم بإعداد لوحة الموائع الدقيقة المستخدمة للتخزين على المدى القصير عن طريق إزالة أي وسيط متبقي من الآبار الداخلة وبئر النفايات وبئر تحميل الخلية.
ثم املأ الآبار المستخدمة في الممر A وآبار الممرات غير المستخدمة ب PBS معقمة. أخيرا ، أغلق اللوحة بغشاء الكمثرى لمنعه من الجفاف. وقم بتخزين الطبق على أربع درجات مئوية.