JoVE Encyclopedia of Experiments
علم الأحياء الدقيقة
0 مشاهدات • 2:20 د • September 26th, 2025
ابدأ بنبات تجريبي به مناطق أوراق معدلة وراثيا تعبر عن أجزاء كبيرة غير فلورية من بروتين الفلورسنت الأخضر أو sfGFP.
قم بحقن هذه المناطق المعدلة ببكتيريا Pseudomonas التي تحتوي على بروتينات مستجيبة موسومة بجزء صغير غير فلوري من sfGFP.
احتضان للسماح بالتفاعل بين البكتيريا وخلايا الأوراق.
باستخدام نظام إفراز متخصص ، يقوم Pseudomonas بتوصيل البروتينات المستجيبة الموسومة إلى العصارة الخلوية للورقة.
يتيح القرب بين شظايا GFP الكبيرة والصغيرة تجميعها في sfGFP الفلوري الوظيفي ، والذي ينتقل بعد ذلك إلى غشاء البلازما.
بعد الحضانة ، قم بإزالة أقراص الأوراق من المناطق المحقونة.
تصور هذه الأقراص باستخدام مجهر متحد البؤر بالليزر.
في البداية ، قم بتصوير قرص الورقة بكثافة ليزر منخفضة لتقليل التألق الذاتي. ثم قم بزيادة قوة الليزر لتعزيز الرؤية.
يؤكد التألق الأخضر نجاح العدوى البكتيرية وتوصيل البروتين المستجيب إلى الخلايا النباتية.
بالنسبة لأوراق Nicotiana benthamiana ، قم بالتسلل إلى معلق Pseudomonas إلى نفس المنطقة التي تم فيها تسلل Agrobacterium قبل يومين.
أخيرا ، قم بقطع قرص أوراق من الأوراق الملقحة بالسودوموناس. في نقاط زمنية محددة بعد تسلل الزائفة ، استخدم نظام مسح ليزر متحد البؤر لتصوير قرصين من الأوراق بطول سنتيمتر مربع من النبات الواحد. راقب الخلايا البعيدة عن فتحة التسلل لتجنب قتل الخلايا الميتة بسبب الإصابة.
المؤثرات المنقولة من البكتيريا موجودة فقط بكميات صغيرة جدا. لذلك ، يمكنك زيادة قوة الليزر والحصول على انبعاث مضان للكشف عن إشارة الفلورسنت. ومع ذلك ، لا تتغلب على تجنب التقاط إشارة خاطئة من التألق الذاتي من الخلايا النباتية.