التحقيق في الاستجابة البكتيرية للإيثيلين باستخدام مركب يطلق الإيثيلين

ابدأ بصفيحة متعددة الآبار تحتوي على وسائط نمو ملقحة مسبقا بالبكتيريا المنتجة للسليلوز.

في البئر المعالج ، يتم استكمال الوسائط بحمض 2-كلورو إيثيل فوسفونيك (CEPA).

أغلق اللوحة لمنع تبادل الغازات واحتضانها.

أثناء الحضانة ، يتحلل CEPA ويطلق الإيثيلين ، وهو جزيء غازي.

ينشط الإيثيلين سينسيز السليلوز البكتيري ، والذي يستخدم العصارة الخلوية UDP-glucose لتصنيع السليلوز.

بمرور الوقت ، تقوم البكتيريا ببثق السليلوز من خلال غشاءها.

هذا يعزز التجميع الذاتي للبكتيريا في واجهة الهواء والسائل ، مكونا غشاء حيوي عائم قائم على السليلوز ، أو بيليك.

بعد الحضانة ، انقل الحبيبات إلى طبق جديد متعدد الآبار. أضف محلولا قلويا واحتضان عند درجة حرارة أعلى لتحلل الخلايا.

قم بإزالة المحلول القلوي. اغسل بشكل متكرر بالتحريض لإزالة الحطام الخلوي مع الاحتفاظ بالسليلوز.

جفف ووزن الحبيبات. يشير الوزن الجاف المرتفع في العينات المعالجة ب CEPA مقارنة بالعنصر الشاهد إلى زيادة إنتاج السليلوز البكتيري استجابة للإيثيلين.

اختبار الحبيبات هو أداة تحليل قياسية لإنتاج السليلوز البكتيري. يتم تفصيل الرقم الهيدروجيني والتحليل المورفولوجي في بروتوكول النص. في التحضير ، قم بحصاد الخلايا من الثقافات البادئة في ثلاث نسخ وتحديد الخلايا باستخدام غرفة عد بتروف هاوزر.

بعد ذلك ، قم بإعداد أربعة خلطات رئيسية متوسطة بتركيزات مختلفة من CEPA. لكل مزيج رئيسي ، قم بإضافة 60 مل من وسط الأس الهيدروجيني 7 SH وأضف 120 ميكرولتر من محلول مخزون CEPA 0 أو 5 أو 50 أو 500 ملليمولار للحصول على تركيزات CEPA النهائية من 0 أو 0.01 أو 0.1 أو 1.0 ملليمولار. امزج هذه الوسائط عن طريق تدوير القوارير.

هناك حاجة إلى مجموعة واحدة من الوسائط لكل من التكرارات الثلاثية وهناك حاجة إلى مجموعة رابعة لتعمل كعنصر تحكم معقم. لذلك ، قسم كل مستحضر متوسط 60 مليلتر إلى أربعة أضواء 14 مل. بعد ذلك ، قم بتبريد 14 ملليلترا مسبقا قبل التلقيح بمزارع البداية الخاصة بها للحصول على تركيز نهائي يبلغ 100,000 خلية لكل مليلتر.

احتفظ بجميع الأنابيب الملقحة على الثلج لمنع إنتاج السليلوز. استخدم 14 مليلتر المتبقية لآبار التحكم المعقمة. الآن ، من كل مزيج رئيسي سعة 14 مليلتر ، قم بتحميل اثنين من الأجزاء المليلترة في ستة آبار من صفيحة بئر 24 بئر معقمة ليصبح المجموع أربعة ألواح محملة لكل ثقافة بداية تم تحليلها.

أغلق الألواح بعناية بغشاء البارافين واحتضنها بشكل ثابت لمدة سبعة أيام عند 30 درجة مئوية. لجمع حبيبات من اللوحة ، اضغط على جانب واحد من الحبيبات لرفع الحافة المقابلة والتقاطها بالملقط.

بعد ذلك ، قم بنقل الحبيبات بشكل فردي إلى آبار صفيحة بستة آبار. عالجها ب 12 مل من 0.1 هيدروكسيد الصوديوم الطبيعي عند 80 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة لتحلل الخلايا. بعد ذلك ، قم بإزالة هيدروكسيد الصوديوم وتحييد الحبيبات المعالجة عن طريق غسلها جيدا ب 12 مل من الماء فائق النقاء لمدة 24 ساعة مع التحريض في طبق من ستة آبار.

خلال هذه الحضانة ، قم بتغيير الماء كل ست ساعات. عند انتهاء الحضانة ، يجب أن تكون الحبيبات بيضاء. ثم ضع الحبيبات على حصائر السيليكون وجففها على حرارة 50 درجة مئوية لمدة 48 ساعة لتحضيرها لقياس الوزن الجاف.