موسوعة JoVE للتجارب
علم الأحياء الدقيقة
0 مشاهدة • 2:41 دقيقة • September 26th, 2025
ابدأ بحبيبات بكتيرية. تحتوي البكتيريا على جين يشفر بروتين بادئ ولكنها تفتقر إلى جين مقاومة المضادات الحيوية.
أعد تعليق الحبيبات في الماء البارد لتقليل التدهور الخلوي.
خذ بلازميدا يحمل جين مقاومة للمضادات الحيوية وجين مستهدف. يسمى هذا البلازميد ببلازميد الانتحار لأنه لا يمكن أن يتكاثر بدون البروتين البادئ.
أضف البلازميد إلى المعلق البكتيري.
انقل المعلق إلى كوفيت مبرد.
ابدأ التثقيب الكهربائي عن طريق تطبيق نبضة عالية الجهد تعطل الغشاء البكتيري بشكل عابر ، مما يسمح للبلازميد بالدخول.
أضف وسائط الاسترداد وانقل الخليط إلى أنبوب ثقافة.
احتضان مع الاهتزاز.
خذ صفيحة أجار تحتوي على المضاد الحيوي وقم بوضع الثقافة.
يرتبط البروتين البكتيري المبادئ بأصل النسخ المتماثل ، مما يمكن البلازميد من التكاثر والتعبير عن بروتين مقاوم للمضادات الحيوية.
هذا يسمح للبكتيريا التي تحتوي على البلازميد بالبقاء على قيد الحياة والنمو ، مما يسهل تضخيم البلازميد.
بيليه ثقافة البكتيريا عن طريق الطرد المركزي عند 5 ، 000 مرة جم وأربع درجات مئوية لمدة 15 دقيقة. الحبيبات في الماء المقطر المبرد وكرر عملية التنظيف مرتين أخريين.
انقل معلق البكتيريا إلى أنابيب microfuge وكرر الطرد المركزي عند 14 ، 000 مرة G وأربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق. بعد إعادة تعليق الحبيبات في الماء المبرد ، أضف ما يقرب من 3.5 ميكرولتر من خليط الربط واحتضنه على الثلج لمدة خمس دقائق. انقل المحتويات إلى كوفيت ثقب كهربائي مبرد بفجوة ملليمترين.
بعد التثقيب الكهربائي ، أضف وسيط SOC وانقل المحتويات إلى أنبوب مزرعة. احتضان لمدة ساعة واحدة عند 30 درجة مئوية مع الاهتزاز عند 200 دورة في الدقيقة. صفيحة الخلايا المحولة على لوحات أجار LB مكملة مع الكلورامفينيكول.