عزل البكتيريا سالبة الجرام مع إدخالات الينقولات الجينومية

ابدأ بإذابة مزرعة مجمدة للمتبرع المتزاوج والمتلقي البكتيريا سالبة الجرام على الجليد.

تحمل الخلايا المتلقية الينقولات ، وهي أجزاء قصيرة من الحمض النووي تتضمن جين مقاومة للمضاد الحيوي كانامايسين. يتم دمج هذه الينقولات بشكل عشوائي في جينوم المضيف.

أضف المزرعة إلى طبق أجار غني بالمغذيات يحتوي على كانامايسين ولكن بدون مغذيات خاصة بالمانحين.

أضف حبات معقمة وقم بتدوير اللوحة برفق لنشر الثقافة بشكل موحد.

قم بإزالة الخرز واحتضانها. تستخدم البكتيريا المتلقية العناصر الغذائية ، ولكن فقط تلك التي تحتوي على ينقولات متكاملة تقاوم الكانامايسين ، مما يؤدي إلى تكوين المستعمرة.

تفشل البكتيريا المانحة والمتلقية بدون ينقولات في النمو.

عد الوحدات المكونة للمستعمرة لتقدير عدد البكتيريا المتلقية مع إدخالات الينقولات الفريدة.

أضف وسائط جديدة واجمع البكتيريا.

جهاز طرد مركزي لحبيبات البكتيريا والتخلص من المادة الطافية.

أعد تعليق الحبيبات في الوسائط باستخدام واقي من التبريد للحفاظ على بقاء البكتيريا.

قم بإذابة جزء من التزاوج المجمد على الجليد. بعد ذلك ، استخدم حبات زجاجية معقمة لنشر 150 ميكرولتر من التخفيف ، على كل صفيحة أجار Luria-Bertani مقاس 30 × 150 ملم ، مع استكمالها بالكاناميسين.

تخلص من الأنبوب المستخدم الذي يحتوي على التزاوج الزائد ، واحتضن الألواح على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 14 ساعة. بعد الحضانة ، قم بحساب وحدات تشكيل المستعمرة على كل لوحة لتقدير إجمالي المسوخ في مكتبة الينقولات. عد 20٪ من ثلاث لوحات على الأقل لتحديد تقدير عدد المستعمرات لمجموعة الألواح بأكملها.

بعد حساب العائد المقدر للمستعمرة ، أضف ثلاثة إلى خمسة ملليلتر من LB إلى كل لوحة ، وكشط البكتيريا باستخدام أداة كشط معقمة. اسحب المعلقات البكتيرية من جميع الألواح إلى أنابيب مخروطية سعة 50 ملليلتر ، وقم بتثقيب المعلقات عن طريق الطرد المركزي عند 5،000 مرة G ، لمدة سبع دقائق. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في خمسة ملليلتر من الرطل ، مع 30٪ جلسرين.

بعد ذلك ، قم بعمل كمية مليلتر واحدة من مكتبة الينقولات في التبريد وقم بتخزينها عند 80 درجة مئوية تحت الصفر.