زراعة وصيانة البكتيريا المعبرة عن الحمض النووي الريبي

ابدأ بصفيحة تحتوي على بكتيريا معبرة من تداخل الحمض النووي الريبي أو الحمض النووي الريبي المزروعة مسبقا.

تحمل هذه البكتيريا البلازميدات التي تحتوي على جين مقاومة للمضادات الحيوية وإدخال جين مستهدف ينتج RNA مزدوج الشريطة أو dsRNA لتثبيط التعبير الجيني المحدد في المضيف.

باستخدام دبوس معقم ، انقل المستعمرات إلى صفيحة عميقة تحتوي على وسط مكمل بالمضادات الحيوية.

احتضان اللوحة بالاهتزاز لنمو بكتيريا موحد ، حيث توفر الآبار العميقة التهوية.

يقضي المضاد الحيوي على البكتيريا التي تفتقر إلى البلازميد ، مما يضمن بقاء البكتيريا الحاملة للبلازميد فقط.

قم بالطرد المركزي في اللوحة لفصل البكتيريا ، والتخلص من المادة الطافية.

أعد تعليق البكتيريا في محلول ملحي مخزن مؤقت لتثبيتها.

قم بتوزيع البكتيريا المعلقة في طبق متعدد الآبار يحتوي على وسط غني بالمغذيات مكمل بمضاد حيوي ومحفز.

يختار المضاد الحيوي البكتيريا الحاملة للبلازميد ، بينما يؤدي المحفز إلى تعبير dsRNA.

اللوحة المزروعة بالبكتيريا التي تعبر عن RNAi جاهزة لمزيد من الفحوصات.

لاختبار سلالات بكتيرية متعددة من RNAi بالتوازي في بئر واحد من صفيحة بئر عميقة 24 بئرا ، قم بتلقيح مستعمرة واحدة من كل استنساخ من البكتيريا المحتوية على الحمض النووي الريبي المحضرة مسبقا إلى أربعة ملليلتر من الكاربينيسيلين المكمل LB. ضع الألواح في حاضنة اهتزاز محسنة للألواح متعددة الآبار عند 37 درجة مئوية و 950 دورة في الدقيقة لمدة 16 ساعة ، ثم اجمع البكتيريا عن طريق الطرد المركزي عند 2,000 جم لمدة 5 دقائق. صب المادة الطافية عن طريق قلب اللوحة ورجها بقوة.

باستخدام 100 ميكرولتر من S Basal ، قم بتعليق بكتيريا RNAi. قم بماصة البكتيريا المعلقة في عدد مناسب من الآبار للوحة NGM متعددة الآبار مكملة ب IPTG و carbenicillin والسماح للوحة بالجفاف.