التحليل المجهري لنمو البكتيريا تحت الإجهاد باستخدام غرف الموائع الدقيقة

ابدأ بلوحة موائع دقيقة مملوءة بوسط مغذي مسخن مسبقا.

قم بتوصيل اللوحة بنظام المشعب وأغلق الإعداد. قم بقيادة الوسيط عبر القنوات لإزالة أي فقاعات هواء.

ضع الإعداد على مرحلة المجهر وقم بتسخينه مسبقا لمنع تمدد اللوحة أثناء التصوير.

بعد ذلك ، قم بإزالة الوسيط ، وأدخل ثقافة بكتيرية في مداخل الخلية ، ووسط مثير للإجهاد في مداخل المحلول.

يحتوي الوسط المسبب للإجهاد على مضاد حيوي يوقف انقسام الخلايا دون تثبيط زيادة الكتلة الخلوية.

أغلق النظام ، ثم ابدأ تحميل الخلية لنقل البكتيريا إلى غرفة الاستزراع في اللوحة.

باستخدام الضوء المرسل ، حدد مجال رؤية يحتوي على خلايا مفردة موزعة بالتساوي.

حقن الغرفة بالوسط المسبب للإجهاد لتعريض الخلايا للمضاد الحيوي.

باستخدام وضع تباين الطور ، التقط صورا بفاصل زمني لمراقبة تكوين الخلايا الخيطية الممدودة مع زيادة محتوى الحمض النووي الناجم عن تثبيط انقسام الخلايا بوساطة المضادات الحيوية.

أولا ، قم بإزالة محلول الحفظ من لوحة الموائع الدقيقة واستبدله بوسط جديد مسخن مسبقا إلى 37 درجة مئوية كما هو موضح في دليل مستخدم برنامج الموائع الدقيقة. قم بتوصيل لوحة الموائع الدقيقة بنظام المشعب.

وفي برنامج الموائع الدقيقة ، انقر فوق الزر "الختم" لإغلاق اللوحة بنظام المشعب. بعد ذلك ، انقر فوق الزر "فتيلة". ضع لوحة الموائع الدقيقة مع نظام المشعب على مرحلة المجهر وقم بالتسخين المسبق عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين لتجنب تمدد غرفة الموائع الدقيقة.

أغلق لوحة الموائع الدقيقة على نظام الموائع الدقيقة بالنقر فوق الزر Seal Off. استبدل الوسط من البئر الثامنة ب 150 ميكرولتر من عينة المزرعة واستبدل الوسط من البئر الأول إلى الخامس بالوسط المطلوب ، مع أو بدون الكاشف المسبب للإجهاد. أغلق لوحة الموائع الدقيقة وضعها على مرحلة المجهر.

في برنامج الموائع الدقيقة ، قم بتشغيل إجراء تحميل الخلية. تأكد من أن تحميل الخلايا مرض من خلال النظر تحت المجهر في الضوء المنقول. ركز بعناية في وضع الضوء المنقول وحدد العديد من مجالات الرؤية التي تظهر البكتيريا المعزولة وليست مكتظة ، حوالي 10 إلى 20 خلية لكل 100 ميكرولتر مربع.

في برنامج الموائع الدقيقة ، انقر فوق الزر تشغيل تسلسل مخصص ، ثم قم ببرمجة حقن الوسط المسبب للإجهاد خلال 10 دقائق عند اثنين من PSI ، متبوعا بالحقن عند PSI واحد للمدة المطلوبة لعلاج الإجهاد. قم بإجراء التصوير المجهري في وضع الفاصل الزمني بإطار واحد كل 10 دقائق ، باستخدام تباين الطور في الضوء المرسل ومصدر ضوء إثارة 560 نانومتر لإشارة mCherry إذا لزم الأمر. ابدأ الحصول على الصور المجهرية وبروتوكول حقن الموائع الدقيقة في نفس الوقت.