إنتاج البروتين المؤتلف والتعافي من الحويصلات المشتقة من البكتيريا

ابدأ بثقافة الأنواع البكتيرية التي تشفر البروتينات المؤتلفة الموسومة بببتيد الحويصلة ، أو VNp ، وهو ببتيد قصير يعزز تكوين الحويصلة.

أضف محفزا إلى المزرعة واحتضنها. يحفز المحفز تعبير البروتين.

يدمج VNp في الغشاء الداخلي ويعزز انحناء الغشاء ، ويغلف البروتينات الموسومة ب VNp في حويصلات ناشئة.

انقل الوسط الغني بالحويصلات إلى أنبوب. قم بالطرد المركزي لفصل المادة الطافية الغنية بالحويصلات.

بعد ذلك ، قم بتصفية المادة الطافية لإزالة الملوثات المتبقية.

بعد ذلك ، قم بتمرير المرشح عبر مرشح غشائي آخر لالتقاط الحويصلات على سطح الغشاء.

ضع الغشاء في طبق وأضف المحلول الملحي المخزن بالفوسفات.

افصل الحويصلات برفق وانقل المعلق إلى أنبوب نظيف.

صوتنة المعلق لتعطيل أغشية الحويصلة وإطلاق البروتينات.

جهاز طرد مركزي للمحللة لفصل شظايا الغشاء.

يحتوي المادة الطافية الناتجة على بروتينات مؤتلفة نقية وجاهزة للتحليل.

تحفيز تعبير البروتين المؤتلف من محفز T7 عن طريق إضافة IPTG إلى تركيز نهائي يصل إلى 20 ميكروغراما لكل مليلتر ، أو 84 ميكرومولار. بعد إتاحة وقت كاف للتحريض ، قم بإزالة الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 3000 جم و 4 درجات مئوية لمدة 20 دقيقة. قم بتمرير المادة الطافية من خلال مرشح PES معقم وخالي من المنظفات سعة 0.45 ميكرون لتعقيم الوسائط المحتوية على الحويصلة للتخزين طويل الأجل.

لتركيز الحويصلات في حجم أصغر ، قم بتمرير الحويصلة المعقمة المحتوية على الوسائط من خلال مرشح MCE معقم وخالي من المنظفات 0.1 ميكرون. بعد ذلك ، اغسل الغشاء برفق ب 0.5 إلى 1 مل من محلول ملحي معقم من الفوسفات ، أو PBS ، واستخدم مكشطة خلوية أو موزعة بلاستيكية لإزالة الحويصلات بعناية من الغشاء. انقل مركز الحويصلة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد باستخدام ماصة.

يمكن تخزين الحويصلات المنقاة عند 4 درجات مئوية. سونيكيت البروتين المحتوي على حويصلات في الوسط المعقم باستخدام جدول زمني مناسب لتعطيل أغشية الدهون الحويصلية وإطلاق البروتين. الطرد المركزي تعليق صوتنة في 39,000 غرام و 4 درجات مئوية لمدة 20 دقيقة لإزالة الحطام الحويصلي.