القياس الكمي للتعطيل البكتيري الناجم عن الضوء من خلال توليد أنواع الأكسجين التفاعلية

ابدأ بخليط تفاعل مخزن مؤقت يحتوي على L-methionine ، ومتبرع للإلكترون ، وتيترازوليوم أزرق نيترو أو NBT ، ومؤشر أكسدة الاختزال ، وأحادي نوكليوتيد فلافين أو FMN ، وهو محسس للضوء.

أضف هذا الخليط إلى أنبوب يحتوي على الحبيبات البكتيرية والدوامة.

انقل المحلول إلى أنبوب زجاجي.

الآن ، قم بإشعاع الخليط بالضوء البنفسجي لتنشيط FMN ، الذي يقبل إلكترونا من L-methionine ، مكونا وسيطا تفاعليا.

ينقل هذا الوسيط الإلكترون إلى الأكسجين الجزيئي المذاب ، مما يولد أنواعا تفاعلية من الأكسجين أو ROS بالقرب من سطح البكتيريا.

يؤدي ROS الناتج إلى إتلاف المكونات الخلوية ويقلل من قابلية البكتيريا.

يقلل ROS أيضا من NBT إلى فورمازان ، وهو منتج أزرق اللون يترسب بالقرب من سطح البكتيريا.

انقل الخليط إلى أنبوب ، وقم بالطرد المركزي ، وتخلص من المادة الطافية.

أعد تعليق الحبيبات في مذيب عضوي لإذابة الفورمازان.

أخيرا ، قم بقياس الامتصاص لتحديد التعطيل البكتيري الناجم عن الضوء من خلال توليد ROS.

قم بإعداد عينات المكورات العنقودية الذهبية كما هو موضح سابقا للحصول على حبيبات خلية. إلى 75 ملليلتر من الفوسفات المخزن المؤقت أضف 0.1093 جرام من L-methionine و 0.1 جرام من NBT و 25 ملليلترا من محلول FMN.

أضف مليلترا واحدا من كل محلول متفاعل بتركيزات متفاوتة من FMN إلى كريات الخلية والدوامة. قم بإشعاع المحاليل تحت الضوء البنفسجي بمعدل 10 واط لكل متر مربع لمدة 10 دقائق. قم بالطرد المركزي للخليط على حرارة 14,000 جم لمدة 10 دقائق وصبي المادة الطافية.

أعد تعليق الحبيبات في مليلتر واحد من ثنائي ميثيل سلفوكسيد لاستخراج NBT المخفض. سجل الامتصاص عند 560 نانومتر.