مثبطات فحص البيروفوسفاتيز المرتبط بالغشاء البكتيري باستخدام مقايسة الألوان

البيروفوسفاتيز المرتبط بالغشاء البكتيري ، أو mPPase ، يحلل البيروفوسفات إلى أورثوفوسفات أثناء ضخ أيونات الصوديوم عبر الغشاء.

لتقييم تأثيرات المثبطات ضد mPPases ، أضف تركيزات متزايدة من معايير الفوسفات إلى شرائط الأنبوب.

أدخل مركبات الاختبار ، التي قد تمنع mPPase ، في الأنابيب ، تاركا أحدها بالماء كعنصر تحكم.

أضف mPPases المضمنة في الجسيمات الشحمية المشتقة من البكتيريا المحبة للحرارة Thermotoga maritima إلى جميع الأنابيب باستثناء المعايير.

ختم واحتضان في درجة الحرارة المثلى لتنشيط الإنزيم.

أضف بيروفوسفات الصوديوم لبدء التفاعل وإطلاق أورثوفوسفات.

انقل الأنابيب إلى منصة تبريد لإيقاف التفاعل وأجهزة الطرد المركزي لإزالة التكثيف.

أضف كاشف الموليبدات الأسكوربات للتفاعل مع أورثوفوسفات وتشكيل حمض الفوسفوفوليبديك.

أضف محلول الزرنيخ والسترات لتقليل الحمض ، لتشكيل مركب أزرق مستقر.

انقل المحتويات إلى صفيحة متعددة الآبار وقم بقياس الامتصاص.

يشير الامتصاص المنخفض مقارنة بعنصر التحكم إلى تثبيط mPPase ، بينما تعمل المعايير كمرجع لقياس كمية الفوسفات.

أضف مليلترا واحدا من المحلول B إلى 10 ملليلتر من المحلول A ، واخلطه يدويا ، وقم بتخزين المحلول على الثلج.

باستخدام ماصة متعددة القنوات ، أضف 40 ميكرولتر من معيار الفوسفات الميكرومولار 0 و 62.5 و 250 و 500 ميكرومولار إلى البرامج النصية الأنبوبية في ثلاث نسخ.

ثم أضف 2