JoVE Encyclopedia of Experiments
علم الأحياء الدقيقة
0 مشاهدات • 2:04 د • October 30th, 2025
ابدأ بخلايا الأميبا من النوع البري Dictyostelium discoideum معلقة في مخزن مؤقت بارد.
يوفر المخزن المؤقت بيئة أيونية تحافظ على استقرار الغشاء.
بعد ذلك ، أضف خلايا الأميبا إلى أنبوب يحتوي على بلازميد مع الجين المستهدف.
امزج المحلول برفق لجعل البلازميدات على اتصال وثيق بسطح الأميبا.
انقل هذا الخليط إلى كوفيت للتثقيب الكهربائي المبرد مسبقا وقم بإجراء التثقيب الكهربائي.
أثناء التثقيب الكهربائي ، تخلق النبضات الكهربائية مسام عابرة في غشاء الخلية.
يدخل البلازميد من خلال هذه المسام إلى السيتوبلازم وينتقل لاحقا إلى النواة.
بعد ذلك ، انقل خلايا الأميبا إلى طبق بتري يحتوي على وسط سائل مكمل بالبكتيريا المغذية.
تستهلك الأميبا البكتيريا عن طريق البلعمة ، مما يوفر العناصر الغذائية الأساسية لاستعادة الخلايا وتمكين التعبير عن البلازميد.
تدعم البكتيريا المغذية تعداء خلايا الأميبا من النوع البري ، دون الحاجة إلى سلالات خاصة تنمو بدون بكتيريا.
أعد تعليق الخلايا في المخزن المؤقت H40.
بعد ذلك ، أضف 100 ميكرولتر من الخلايا إلى أنبوب يحتوي على ميكروغرام إلى ميكروغرام من الحمض النووي. ماصة لأعلى ولأسفل لخلط ونقل خليط الحمض النووي للخلية إلى كوفيت التثقيب الكهربائي المبرد مسبقا.
لا تضيف أكثر من ميكروغرامين من الحمض النووي. تركيز الحمض النووي العالي سام للخلايا ويقلل من الكفاءة.
بعد التثقيب الكهربائي ، انقل الخلايا على الفور إلى طبق بتري معد بطول 10 سم واسمح للخلايا بالتعافي لمدة خمس ساعات.