لماذا تُعد كروماتوغرافيا استبعاد الحجم مهمة لتنقية نطاق P لفيروس نورو؟

تعمل هذه العملية على فصل نطاق P المستهدف عن الشوائب بناءً على الحجم، مما يتيح عزل الثنائيات المطوية بشكل صحيح لإجراء الدراسات التركيبية والوظيفية.

كيف يدعم توازن المنظم سلامة البروتين أثناء الكروماتوغرافيا؟

تحافظ عملية التوازن على الاستقرار البنيوي للنطاق P من خلال توفير بيئة فيزيائية كيميائية ثابتة طوال عملية الفصل.

ما الذي يكشف عنه مراقبة الامتصاص بالأشعة فوق البنفسجية أثناء عملية الشطف؟

يكشف امتصاص الأشعة فوق البنفسجية (UV absorbance) عن قمم شطف البروتين، حيث يشير الارتفاع إلى تحرر النطاق P، بينما تظهر قمة صغيرة شطف الشوائب في وقت مبكر.

لماذا تعد عمليات التجزيء والجمع ضرورية بعد الشطف؟

يتيح جمع أجزاء بحجم 1.5 mL عزل ذروة نطاق P، والتي يتم شطفها عادةً كدايمر (dimer)، وذلك لإجراء التحليلات اللاحقة.

كيف يؤكد تحليل SDS-PAGE نجاح عملية التنقية؟

يتحقق تحليل SDS-PAGE للأجزاء المستخلصة من النقاء من خلال إظهار حزمة نطاق P وغياب البروتينات الملوثة.

تنقية بروتينات المجال P المؤتلف المشتقة من البكتيريا من نوروفيروس بشري

JoVE Encyclopedia of Experiments

علم الأحياء الدقيقة

0 مشاهدات • 2:01 د • October 30th, 2025

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

خذ عمود كروماتوغرافيا لاستبعاد الحجم مليئا بخرز جل كروي مسامي.

قم بموازنة العمود باستخدام مخزن مؤقت يحافظ على السلامة الهيكلية للبروتينات أثناء الفصل.

قم بتحميل مستخلص بكتيري منقى يحتوي على بروتينات مجال نوروفيروس بشري P المعبر عنها مؤتلفا وشوائب البروتين المتبقية.

أضف المخزن المؤقت لدفع العينة عبر العمود.

لا يمكن للشوائب الكبيرة المتبقية أن تدخل المسام وتمر عبر الفراغات بين الخرز ، وتتسرب أولا.

مراقبة الشطف باستخدام امتصاص الأشعة فوق البنفسجية. تشير الذروة الصغيرة إلى خروج الشوائب من العمود.

في المقابل ، تدخل بروتينات المجال P الصغيرة إلى مسام الخرزة ، وتسافر في مسار أطول ، وتتلاشى لاحقا. يشير الارتفاع في ذروة الامتصاص إلى شطف بروتينات المجال P.

اجمع الكسور الممسولة التي تحتوي على بروتينات المجال P ، والتي أصبحت الآن جاهزة لمزيد من التحليل.

اغسل المضخات والأنابيب الخاصة بنظام تنقية الكروماتوغرافيا السائلة عالي الأداء ، وقم بموازنة عمود كروماتوغرافيا استبعاد الحجم مسبقا باستخدام مخزن ترشيح الهلام. قم بحقن المجال P على العمود بمعدل تدفق يبلغ ملليلتر واحد في الدقيقة ، باستخدام حلقة فائقة أو حلقة ، اعتمادا على حجم العينة المركزة. بعد الانتهاء من الحقن ، قم بزيادة معدل التدفق إلى 2.5 ملليلتر في الدقيقة.

مع زيادة الكثافة الضوئية ، وخروج المجال P من العمود ، اجمع كسورا مقدارها 1.5 ملليلتر. عادة ما يتم مسح المجال P كثنائي