المجهري بفاصل زمني للموائع الدقيقة لدراسة ثبات المضادات الحيوية في البكتيريا

ابدأ بالخلايا البكتيرية التي تنمو بشكل كبير تعبر عن بروتين اندماج مرتبط بالحمض النووي المسمى بشكل فلوري لتصور النواة.

أضف الخلايا إلى مداخل الخلايا للوحة الموائع الدقيقة المعدة مسبقا.

بعد ذلك ، أدخل الوسائط المحتوية على المضادات الحيوية والوسائط الخالية من المضادات الحيوية في مداخل محلول منفصلة.

أغلق اللوحة ، وقم بتثبيتها على مرحلة المجهر ، وابدأ التصوير بفاصل زمني.

أولا ، قم بتحميل الخلايا في غرفة الاستزراع.

بعد ذلك ، قم بإدخال وسائط خالية من المضادات الحيوية في الغرفة لدعم نمو الخلايا الأسي.

أخيرا ، أدخل الوسائط المحتوية على المضادات الحيوية.

يؤدي المضاد الحيوي إلى كسر الحمض النووي مزدوج الخيط ، مما يقتل الخلايا الحساسة. تظهر هذه الخلايا نيوكليويدات مضغوطة وغير متكاثرة مع مضان مستقر.

عد إلى الوسائط الخالية من المضادات الحيوية لتعزيز الشفاء.

الخلايا الدائمة - مجموعة سكانية صغيرة تنجو من العلاج بالمضادات الحيوية - تستأنف تكرار الحمض النووي ، وتستطيل ، وتنقسم.

يؤدي هذا التعافي إلى زيادة التألق في الخلايا الثابتة ، مما يسمح لها بتمييزها بصريا عن الخلايا الحساسة.

قم بإزالة محلول الحفظ من كل بئر في صفيحة الموائع الدقيقة ، واستبدله بوسط ثقافة طازج. أغلق لوحة الموائع الدقيقة بنظام المشعب بالنقر فوق الزر "الختم" أو من خلال برنامج الموائع الدقيقة.

بعد ذلك ، على واجهة برنامج الموائع الدقيقة ، قم بإجراء تسلسل أولي للتحضير بالنقر فوق تشغيل تسلسل تحضير السائل. احتضان اللوحة في خزانة مجهر يتم التحكم فيها حراريا عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين على الأقل قبل بدء التصوير المجهري. ثم ابدأ تسلسل فتيلة سائل ثان قبل بدء التجربة.

أغلق لوحة الموائع الدقيقة بالنقر فوق Unseal Plate على واجهة برنامج الموائع الدقيقة. استبدل الوسط الموجود في الآبار ب 200 ميكرولتر من الوسط الطازج ، والمضادات الحيوية المحتوية على وسط طازج ، وعينة مزرعة مخففة 0.01 OD في الوسط الطازج. بعد إغلاق لوحة الموائع الدقيقة كما هو موضح من قبل ، ضع اللوحة على هدف المجهر داخل خزانة المجهر.

في برنامج الموائع الدقيقة ، انقر فوق تشغيل تسلسل تحميل الخلية للسماح بتحميل الخلايا في لوحة الموائع الدقيقة. قم بتعيين التركيز البؤري الأمثل باستخدام وضع الضوء المرسل، وحدد عدة مناطق ذات أهمية حيث يمكن ملاحظة عدد خلية مناسب يصل إلى 300 خلية لكل حقل. في برنامج الموائع الدقيقة ، قم بتحرير Run a Custom Sequence لبرمجة حقن الوسط الطازج عند 6.9 كيلو باسكال لمدة ست ساعات إلى الآبار الأولى والثانية ، متبوعا بالوسط الذي يحتوي على مضاد حيوي عند 6.9 كيلو باسكال لمدة ست ساعات إلى ثلاثة بئر ، وأخيرا الوسط الطازج عند 6.9 كيلو باسكال لمدة 24 ساعة إلى الآبار الرابعة والخامسة.

قم بإجراء التصوير المجهري في وضع الفاصل الزمني بإطار واحد كل 15 دقيقة باستخدام الضوء المرسل ومصدر ضوء الإثارة لمراسل الفلورسنت ، وابدأ برنامج الموائع الدقيقة. افتح برنامج ImageJ أو Fiji على الكمبيوتر، واسحب صور الفحص المجهري بفاصل زمني hyperstack إلى شريط تحميل فيجي. استخدم Image، متبوعا بالألوان، ثم Make Composite لدمج القنوات المختلفة للمكدس الفائق.

استخدم الصورة واللون ثم ترتيب القنوات إذا كانت القنوات لا تتوافق مع اللون المطلوب. افتح المكون الإضافي MicrobeJ ، واكتشف الخلايا البكتيرية باستخدام واجهة التحرير اليدوي. احذف الخلايا المكتشفة تلقائيا، وحدد يدويا الخلايا الثابتة ذات الاهتمام إطارا تلو الآخر.

بعد الاكتشاف ، استخدم أيقونة النتيجة في واجهة التحرير اليدوي ل MicrobeJ لإنشاء جدول ResultJ. استخدم جدول ResultJ للحصول على رؤى حول المعلمات المختلفة ذات الأهمية لتحليل الخلية الواحدة، وحفظ ملف ResultJ.