فحص معدلات ممارسات التصنيع الجيدة الدورية باستخدام البكتيريا التي تعبر عن بروتين مراسل الفلورسنت

خذ صفيحة متعددة الآبار تحتوي على بكتيريا مسببة للأمراض المعدلة وراثيا المزروعة بمركبات اختبار مختلفة ، جنبا إلى جنب مع الضوابط السلبية.

تحمل البكتيريا بلازميدا يحتوي على جين يشفر البروتين الفلوري الأخضر أو GFP.

يتم تنشيط محفز الجين بواسطة بروتين يستجيب لتركيزات di-GMP الدورية داخل الخلايا أو c-di-GMP.

ضع الطبق في قارئ اللوحة.

استخدم التحكم السلبي ، الذي يتألق إلى أقصى حد بسبب عدم وجود مثبط c-di-GMP ، لضبط الإعدادات للقياس الأمثل لإشارة التألق.

إذا كان مركب الاختبار يمنع تكوين c-di-GMP ، ينخفض مستوى c-di-GMP داخل الخلايا.

تؤدي مستويات c-di-GMP المنخفضة إلى تغيير توافقي في البروتين ، مما يؤدي إلى قمع المروج وانخفاض تعبير GFP ، مما يؤدي إلى انخفاض التألق.

قياس التألق وتحليل البيانات لتحديد مركبات الاختبار التي تعدل مستويات c-di-GMP داخل الخلايا في البكتيريا المسببة للأمراض.

قبل حوالي 30 دقيقة من القياس الطيفي الضوئي ، قم بتسخين قارئ اللوحة مسبقا إلى 37 درجة مئوية لتجنب التكثيف. قم بإزالة ختم الغطاء المنفذ للهواء برفق من اللوحة قبل القراءة.

بعد ذلك ، قم بقياس الكثافة الضوئية بطول موجي 600 نانومتر مع إعداد 10 ومضات لكل بئر ووقت استقرار 0.2 ثانية. قبل قياس التألق ، قم بإجراء كسب تلقائي وضبط بؤري بناء على بئر التحكم السلبي A24 وقم بتعيين القيمة المستهدفة للكسب عند 75٪.

حدد ضبط التركيز والقناة A على