القياس الكمي للوحدات المكونة للمستعمرة للبكتيريا المرتبطة بالقناة الهضمية في ذبابة الفاكهة

ابدأ بصفيحة صغيرة تحتوي على متجانسات محضرة من ذبابة الفاكهة الذبابة. كان هذا الذباب يؤوي مجموعة خاضعة للرقابة من بكتيريا معينة في أمعائه.

تحتوي المتجانسات على أنسجة ذبابة متحللة وبكتيريا الأمعاء.

استنشاق البكتيريا العالقة وتخفيفها بشكل متسلسل عبر ألواح دقيقة متعددة.

اكتشف كميات صغيرة من كل تخفيف على ألواح أجار ، مما يضمن بقاء القطرات منفصلة.

احتضان للسماح للبكتيريا بالتكاثر في مستعمرات مرئية.

التقط صورا للألواح لتحديد وحدات تكوين المستعمرة (CFUs) ، والتي تمثل عدد الخلايا البكتيرية القابلة للحياة القادرة على تكوين مستعمرات فردية.

باستخدام برنامج تحليل الصور ، قم بمحاذاة كل صورة باستخدام خط مرجعي ، وحدد حدودا ، وقم بتطبيق شبكة موحدة لتقسيمها إلى مناطق عد ، كل منها يتوافق مع بقعة واحدة.

اضبط عتبة السطوع لتمييز المستعمرات الفردية عن الخلفية ، ثم قم بتشغيل التحليل لحساب المستعمرات في كل بقعة وتحديد وحدات CFUs.

ضع ثلاث ألواح مستطيلة لنمو أجار MRS مع فتح أغطيتها في خزانة السلامة الحيوية لتجف لمدة 10 دقائق على الأقل. قم بإعداد لوحين مخففين عن طريق إضافة 100 ميكرولتر من PBS إلى كل بئر من صفيحة معقمة ذات 96 بئرا باستخدام ماصة ذات 96 قناة. قم بتحميل حامل من أطراف P-20 على الماصة ذات 96 قناة.

قم بعمل تخفيف بنسبة 1:10 عن طريق شفط 11.1 ميكرولتر من المتجانس من لوحة العينة. الآن ، قم بتوزيعه في أول لوحة تخفيف تحتوي على 100 ميكرولتر من PBS المعقمة لكل بئر. احتفظ بلوحة التخفيف على شاكر اللوحة لمدة 10 ثوان عند 600 دورة في الدقيقة.

امزج مرة أخرى عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل 10 مرات على الأقل. انقل 11.1 ميكرولتر من لوحة التخفيف الأولى إلى لوحة التخفيف الثانية وكرر خطوات الخلط لأي تخفيفات أخرى. لاكتشاف الألواح ، قم بتحميل ميكرولترين من كل بئر في الماصة ذات 96 قناة.

اخفض رأس الماصة ببطء على اللوحة ، وتجنب الطعن في الأجار ، وتأكد من توزيع جميع البقع. بعد ذلك ، تأكد من أن البقع السائلة تنقع بسرعة في الأجار ولا تعمل معا. كرر عملية الطلاء لألواح التخفيف المتبقية كما هو موضح في المخطوطة.

بمجرد امتصاص السائل بالكامل في الأجار ، اقلب الألواح واحتضنها حتى تصل المستعمرات إلى الحجم الأمثل. قم بتنظيم اللوحات بشكل منطقي واحتفظ بها بترتيب معين أثناء التصوير. قم بتوجيههم بحيث يكون A1 في الزاوية اليسرى العليا لجميع اللوحات.

بعد إزالة غطاء اللوحة ، ضع اللوحة على المسرح مع توجيه A1 في الزاوية الصحيحة. صور اللوحات. انقل الصور إلى جهاز كمبيوتر وأعد تسميتها ، بما في ذلك اسم التجربة ونوع الوسائط وعامل التخفيف والتفاصيل الأخرى ذات الصلة.

قم بتنظيم الصور المراد معالجتها لقياسها كميا في مجلد. تصبح أسماء الملفات التي تميز اللوحات عناوين أعمدة لكل مجموعة من الأعداد في جدول بيانات الإخراج. قم بإنشاء مجلدات فرعية باسم اقتصاص وإيصالات في المجلد.

ستتلقى هذه المجلدات ملفات الإخراج. الآن قم بتشغيل المكون الإضافي Croptacular من ImageJ وانقر فوق "موافق" لبدء الاقتصاص. سيظهر مربع حوار لاختيار المجلد المصدر.

انقر فوق موافق. حدد المجلد المصدر وانقر فوق فتح. ثم انقر فوق موافق في مربع الحوار لاختيار دليل الوجهة. حدد المجلد الوجهة واضغط على فتح.

إذا كانت الصورة مستقيمة بالفعل ، فما عليك سوى الضغط على مسافة. خلاف ذلك ، قم بتصويب الصورة عن طريق رسم خط على طول حافة يجب أن تصبح أفقية. أعد رسم الخط عدة مرات حسب الحاجة إذا لم تظهر الصورة بشكل مستقيم.

بعد ذلك ، ارسم مربعا حدوديا لمنطقة العد واضبط حجمها ونسبتها حتى تصبح جميع البقع داخل خلاياها. اسحب المؤشر خارج مربع الحدود لتحديث الشبكة. عندما تبدو الشبكة جيدة، اضغط على مسافة.

نظرا لأن المكون الإضافي يفترض محاذاة جميع الصور بشكل متماثل ، تأكد من أن الصورة التالية تدور تلقائيا إلى نفس زاوية الصورة الأولى. إذا كان ذلك دقيقا، فاضغط على مسافة للمتابعة. خلاف ذلك ، قم بتصويب الصورة كما كان من قبل.

تستدعي الشبكة أيضا نفس موضع الصورة السابقة. اضبط إذا لزم الأمر واضغط على مسافة. قم بتشغيل Count-On-It وحدد Gridiron.

قم بتعيين شدة مستعمرة العتبة بناء على قيمة كثافة البكسل العلوية والسفلية. اجعل العتبة صارمة قدر الإمكان ، مع الاستمرار في اختيار جميع المستعمرات. انقر فوق موافق في مربع الحوار الإجراء المطلوب عندما يكون الحد مرضيا، ثم انقر فوق موافق للمتابعة.

في الصورة الأولى ، يتم إعطاء خيار المتابعة أو العودة إلى قائمة الإعداد. لمتابعة عملية الدفعة الدفعية، انقر فوق موافق. بعد ذلك، حدد مجلدا للاحتفاظ بجدول الإيصالات والنتائج. استخدم مجلد الإيصالات الذي تم إنشاؤه مسبقا.

بعد الصورة الأولى ، سيتم تعيين الصور التالية افتراضيا إلى نفس الحد مثل الإعدادات السابقة. انقر فوق موافق لاستخدام هذه الإعدادات أو ضبط الإعدادات.