الكشف عن ناقلات المعادن السطحية في النيسرية البنية باستخدام لطخة نقطية

ابدأ بمزرعة نيسريا البنية المزروعة في وسط مستنفد للمعادن.

تؤدي ندرة المعادن إلى التعبير عن ناقلات الغشاء الخارجي التي تبدأ امتصاص المعدن عند توفرها.

ضع غشاء نيتروسليلوز منقوع مسبقا فوق أوراق ترشيح رطبة وقم بتجميع جهاز وصمة عار نقطية.

اكتشف الخلايا البكتيرية واسمح للسائل بالامتصاص.

قم بتفكيك الجهاز وإزالة الغشاء وتجفيفه بالهواء.

أضف عامل حظر لمنع الربط غير المحدد.

أعد إدخال الغشاء في الجهاز ، وأغلقه بالبارافيلم ، وأعد تجميعه.

أضف رابطا ملزما معدنيا مشتقا من المضيف واحتضنه مع الرج.

يرتبط الترابط بالناقلات البكتيرية.

قم بإزالة السائل واغسل الغشاء لإزالة أي رابط غير مرتبط.

أضف جسما مضادا أوليا خاصا بالليجاند ، متبوعا بجسم مضاد ثانوي مترافق بالإنزيم وكاشف للكشف عن الألوان يشكل منتجا ملونا.

تشير الإشارة المرئية إلى التعبير عن ناقلات المعادن البكتيرية في ظل ظروف محدودة المعادن.

بعد حضانة مضاعفة الكتلة ، قم بتخفيف الثقافات مرة أخرى بثلاثة مجلدات من CDM. ثم احتضن الثقافات عند 37 درجة مئوية مع الرج لمدة أربع ساعات. قبل فترة وجيزة من علامة الأربع ساعات ، قم بقص ثلاث قطع من ورق الترشيح وقطعة من النيتروسليلوز إلى الحجم التقريبي اللازم لتناسب جهاز لطخة نقطية.

انقع النيتروسليلوز مسبقا في ماء منزوع الأيونات لمدة 10 دقائق قبل تجميع الجهاز بورق ترشيح أسفل النيتروسليلوز. في نهاية الحضانة ، قم بتسجيل كثافة الخلايا وتوحيد الكثافة إلى كثافة نهائية مناسبة. ثم ، قم بماصة مزارع الخلايا على النيتروسليلوز.

عندما يمتص ورق الترشيح كل السائل ، قم بتفكيك الجهاز واترك اللطخة تجف. قم بسد غشاء النيتروسليلوز لمدة ساعة واحدة بمحلول حجب مناسب وأعد تجميع جهاز اللطخة النقطية ، واستبدال ورق الترشيح بغشاء البارافين لإنشاء ختم مانع للتسرب تحت النيتروسليلوز. قم بتخفيف الترابط المعدني المرتبط بالاهتمام إلى 0.2 ميكرومولار في الحاجز وفحص الخلايا لمدة ساعة واحدة مع اهتزاز معتدل.

في نهاية الحضانة ، قم بسحب السائل بفراغ ، واغسل اللطخة ، واتبع الإجراءات المناعية القياسية لتطوير الإشارة.