قياس معدلات الترجمة الخاطئة للمتفطرة باستخدام نظام GFP / Luciferase Reporter

خذ ثقافة المتفطرة smegmatis التي تؤوي جينات محفزة ل GFP ولوسيفيراز متحولة تحمل علامة إفراز.

يقوم الجين المتحور بتشفير لوسيفيراز غير نشط ، لكن الترجمة الخاطئة الطبيعية أثناء تخليق البروتين تنتج إنزيما نشطا.

يعمل GFP كعنصر تحكم داخلي لتطبيع تعبير لوسيفيراز.

أضف المحفز لبدء التعبير الجيني ، ثم قم بتقسيم المزرعة إلى لوحة متعددة الآبار.

إدخال تركيزات متزايدة لجزيء الاختبار إلى الآبار المختارة. حضن.

في ظل ظروف التحكم ، تؤدي الترجمة الخاطئة إلى إفراز لوسيفيراز نشط.

إذا كان جزيء الاختبار يمنع الترجمة الخاطئة ، فإن إفراز لوسيفيراز النشط ينخفض.

انقل أقاليم الثقافة إلى صفيحة سوداء وقم بقياس مضان GFP.

جهاز طرد مركزي لحبيبات الخلايا.

انقل المواد الطافية التي تحتوي على لوسيفيراز المفرز وأضف الركيزة ، حيث يحفز اللوسيفيراز النشط أكسدته ، مما ينتج عنه تلمين.

قياس اللمعان وحساب نسبة Luciferase / GFP ؛ تشير النسبة المنخفضة إلى انخفاض الترجمة الخاطئة بسبب جزيء الاختبار.

للبدء ، قم بتلقيح ملليلترين من 7H9 وسط بسلالة المراسل البكتيري.

رج العبوة عند 37 درجة مئوية لمدة يوم إلى يومين أو حتى يصل OD عند 600 نانومتر إلى المرحلة الثابتة.

بعد ذلك ، الاستزراع الفرعي في 50 مل من 7H9 وسط وتنمو حتى يصل OD عند 600 نانومتر إلى المرحلة الثابتة المتأخرة. قبل نقل البكتيريا إلى صفيحة 96 بئرا ، أضف ATC بتركيز نهائي يبلغ 50 نانوجرام لكل مليلتر واخلطه جيدا.

أضف 100 ميكرولتر لكل بئر إلى طبق شفاف ذو قاع دائري مكون من 96 بئرا. بعد ذلك ، أضف جرعات مختلفة من Ksg إلى الآبار المختارة لفحص آثارها على معدلات الترجمة الخاطئة. أضف 200 ميكرولتر من الماء المعقم إلى حافة آبار اللوحة للحد من التبخر من آبار العينة.

أغلق اللوحة ورجها وحث العينات على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 16 إلى 20 ساعة. استخدم ماصة متعددة القنوات لأخذ 80 ميكرولتر من كل بئر. انقل العينات إلى لوحة ذات قاع أسود مكونة من 96 بئرا وقم بقياس إشارة GFP بواسطة مقياس الإضاءة

بعد قياس إشارة GFP ، قم بالطرد المركزي للوحة عند 3,220 مرة جم لمدة 10 دقائق. بعد ذلك ، انقل 50 ميكرولتر من المادة الطافية إلى صفيحة ذات قاع أبيض مكونة من 96 بئرا.

ثم أضف 50 ميكرولتر من ركيزة Nluc إلى كل بئر ، واخلطها جيدا ، وقم بقياس اللمعان بواسطة مقياس الإضاءة أخيرا ، حدد نسبة Nluc / GFP بقسمة قيمة تلألؤ Nluc المصححة على مضان GFP.