قياس معدلات الترجمة الخاطئة للمتفطرة باستخدام نظام GFP / Luciferase Reporter

خذ ثقافة المتفطرة smegmatis التي تؤوي جينات محفزة ل GFP ولوسيفيراز متحولة تحمل علامة إفراز.

يقوم الجين المتحور بتشفير لوسيفيراز غير نشط ، لكن الترجمة الخاطئة الطبيعية أثناء تخليق البروتين تنتج إنزيما نشطا.

يعمل GFP كعنصر تحكم داخلي لتطبيع تعبير لوسيفيراز.

أضف المحفز لبدء التعبير الجيني ، ثم قم بتقسيم المزرعة إلى لوحة متعددة الآبار.

إدخال تركيزات متزايدة لجزيء الاختبار إلى الآبار المختارة. حضن.

في ظل ظروف التحكم ، تؤدي الترجمة الخاطئة إلى إفراز لوسيفيراز نشط.

إذا كان جزيء الاختبار يمنع الترجمة الخاطئة ، فإن إفراز لوسيفيراز النشط ينخفض.

انقل أقاليم الثقافة إلى صفيحة سوداء وقم بقياس مضان GFP.

جهاز طرد مركزي لحبيبات الخلايا.

انقل المواد الطافية التي تحتوي على لوسيفيراز المفرز وأضف الركيزة ، حيث يحفز اللوسيفيراز النشط أكسدته ، مما ينتج عنه تلمين.

قياس اللمعان وحساب نسبة Luciferase / GFP ؛ تشير النسبة المنخفضة إلى انخفاض الترجمة الخاطئة بسبب جزيء الاختبار.

للبدء ، قم بتلقيح ملليلترين من 7H9 وسط بسلالة المراسل البكتيري.

رج العبوة عند 37 درجة مئوية لمدة يوم إلى يومين أو حتى يصل OD عند 600 نانومتر إلى المرحلة الثابتة.

بعد ذلك ، الاستزراع الفرعي في 50 مل من 7H9 وسط وتنمو حتى يصل OD عند 600 نانومتر إلى المرحلة الثابتة المتأخرة. قبل نقل البكتيريا إلى صفيحة 96 بئرا ، أضف ATC بتركيز نهائي يبلغ 50 نانوجرام لك