وصمة عار غربية لتقييم السلامة الهيكلية لمستضد اللقاح البكتيري

خذ جل SDS-PAGE يحتوي على عصابات بروتينية من جزيئات البروتين النانوي الغشائي. تحمل هذه المجمعات بروتين الغشاء قلة الكلاميديا أو MP ، وهو مستضد لقاح واعد ضد عدوى الكلاميديا .

استخدم عصابات البروتين من قليل القلة المنقى كعنصر تحكم.

قم بتجميع الجل وغشاء اللطخة الغربية ومكونات النشاف في نظام نشاف جاف.

قم بتطبيق تيار كهربائي لنقل البروتينات المحلولة إلى الغشاء.

قم بإزالة الغشاء واحتضانه في مخزن مؤقت يحتوي على المنظفات والأجسام المضادة الأولية.

تمنع المنظفات مواقع التفاعل غير المحددة ، بينما تستهدف الأجسام المضادة الأولية MP.

اغسل الغشاء لإزالة الأجسام المضادة الأولية غير المرتبطة.

احتضان الأجسام المضادة الثانوية المترافقة بالفلوروفور التي تستهدف الأجسام المضادة الأولية.

اغسل الغشاء لإزالة الأجسام المضادة الثانوية الزائدة.

التقط صورا مضانة للغشاء.

تؤكد النطاقات الجزيئية المطابقة للتحكم في قليل القلة MP السلامة الهيكلية ل MP داخل المجمعات ، مما يدعم إمكاناته المستضدية.

قم بحل العينات بواسطة SDS-PAGE وانقل أكوام الجل باستخدام نظام النشاف الجاف التجاري لتحليل اللطخة الغربية. قم بإزالة البقع من المكدس واحتضانها طوال الليل عند أربع درجات مئوية في مخزن مؤقت مانع يحتوي على 0.2٪ TWEEN 20 و 0.5 ميكروغرام لكل مليلتر MAb40 ، أو 0.2 ميكروغرام لكل مليلتر MAbHIS الأجسام المضادة للعلامة الموجهة ضد علامة HIS-ITS من بروتين delta-49ApoA1.

اغسل كل لطخة باستخدام PBST ثلاث مرات لمدة خمس دقائق لكل غسلة. احتضان البقع لمدة ساعة واحدة في مخزن مؤقت حاجب يحتوي على أجسام مضادة ثانوية مقترنة بالفلوروفور في تخفيف من 1 إلى 10,000. كرر الغسيل باستخدام PBST والتقط الصورة باستخدام جهاز تصوير مضان بعد الغسيل النهائي.