لماذا تعد كفاءة التحول مهمة للتحقق من الهدف في E. coli؟

تضمن كفاءة التحويل العالية الحصول على أعداد كافية من الخلايا المهندسة لضمان تعبير بروتيني موثوق، وهو أمر أساسي للتقييم الدقيق لوظيفة الهدف ومدى مشاركة المسار في مراحل الاكتشاف المبكرة.

كيف يدعم عزل المتغيرات أثناء التثقيب الكهربائي اتساق مسار الاكتشاف؟

إن التحكم في المعلمات مثل الجهد الكهربائي، وطول النبضة، وتحضير الخلايا يقلل من التباين في امتصاص DNA، مما يسمح بتوليد سلالات قابلة للتكرار عبر التجارب والفرق المختلفة.

ما هي القياسات الكمية التي تتيح تقييم نجاح التثقيب الكهربائي في الأنظمة الميكروبية؟

توفر حسابات الوحدات المكونة للمستعمرات على أطباق اختيارية للمضادات الحيوية قياساً مباشراً لكفاءة التحول، مما يسمح للفرق بمقارنة الظروف وتحسين البروتوكولات.

لماذا تعد متطلبات التكرار ضرورية للتعاون متعدد الوظائف في الهندسة الميكروبية؟

يضمن التكرار اتساق نتائج التحويل وقابليتها للنقل بين المختبرات، مما يدعم عملية التسليم الموثوقة من فرق توليد السلالات إلى فرق التعبير والفحص.

ما هي قدرات التحليل الإحصائي المطلوبة قبل تطبيق عملية التثقيب الكهربائي في سير عمل الاكتشاف؟

يجب أن تكون الفرق قادرة على قياس كفاءة التحول، وتقييم التباين عبر المكررات، وتطبيق عتبات النجاح لضمان موثوقية الطريقة في مسارات توليد السلالات.

تحضير وتحويل البكتيريا باستخدام التثقيب الكهربائي عالي الجهد

JoVE Encyclopedia of Experiments

علم الأحياء الدقيقة

0 مشاهدات • 3:33 د • October 30th, 2025

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ابدأ بأنبوب يحتوي على بكتيريا ملقحة في وسط مغذي.

احتضان مع الاهتزاز حتى تصل الخلايا إلى مرحلة الانقسام النشط.

جهاز طرد مركزي لجمع الخلايا والتخلص من الطافية.

اغسل الخلايا بشكل متكرر باستخدام الجلسرين المثلج لإزالة الأملاح وإعادة تعليقها في الجلسرين للحفاظ على بقاء الخلية.

قم بإعداد بلازميد يحتوي على جين مقاوم للمضادات الحيوية في مياه معقمة باستخدام EDTA لمنع تدهور الحمض النووي.

امزج محلول البلازميد مع الخلايا البكتيرية.

ضع نبضة قصيرة عالية الجهد لإنشاء مسام مؤقتا في الغشاء البكتيري.

هذا يسمح للحمض النووي البلازميد بدخول السيتوبلازم.

انقل الخلايا على الفور إلى وسط الاسترداد واحتضان مع الاهتزاز.

تدعم مكونات الوسيط إصلاح الغشاء والتعبير الجيني لمقاومة المضادات الحيوية المشفر بالبلازميد.

انشر الخلايا على أجار المغذيات التي تحتوي على المضاد الحيوي واحتضان حتى تتشكل المستعمرات.

اختر مستعمرة واحدة وقم بوضعها على طبق جديد لتنقية المحولات.

لبدء التجربة ، قم بإعداد الخلايا ذات الكفاءة الكهربائية لأعلى 10 سلالات بكتريا قولونية .

نقل مستعمرة واحدة إلى ملليلتر واحد من وسائط LB. احتضان الأنبوب عند 37 درجة مئوية أثناء الرج عند 180 دورة في الدقيقة. قم بتخفيف ما قبل الاستزراع من واحد إلى 500 في 25 مل من وسائط LB الطازجة واحتضان المزرعة عند 37 درجة مئوية حتى تصل إلى المرحلة اللوغاريتمية 0.6 OD. قم بالطرد المركزي لتعليق الخلية عند 5,000 دورة في الدقيقة لمدة 20 دقيقة.

بعد الطرد المركزي ، أعد تعليق الحبيبات في 25 مل من حجم 10٪ لكل حجم ، ماء جلسرين معقم مثلج ، وكرر هذه الخطوة أربع مرات ، مع الحصول على حجم إعادة التعليق في كل مرة حتى يتم الوصول إلى 1.5 مل.

بعد ذلك ، أعد تعليق الحبيبات في 10٪ جلسرين وقسم تعليق الخلية إلى 50 ميكرولتر من الحصات. قم بتخزين النقاط عند سالب 80 درجة مئوية لمدة تصل إلى ستة أشهر. لمواصلة التجربة ، قم بإذابة البلازميد المطلوب في ماء معقم مكمل ب 0.5 ملليمولار EDTA ، وقم بإذابة جزء من الخلايا الكهربية على الجليد.

أضف 2.5 إلى 5 نانوجرام من المتجه واخلط الخلايا المذابة. وزع الخلايا في كوفيت 0.1 سم. ضع نبضة 1.8 كيلو فولت على الخلايا ، وانقل الخلايا الكهربائية على الفور إلى مليلتر واحد من وسائط SOC.

احتضان الخلايا أثناء الرج لمدة ساعة ، وانقل 100 ميكرولتر إلى أطباق بتري تحتوي على أجار LB والمضادات الحيوية ، واحتضن الخلايا طوال الليل عند 37 درجة مئوية. قم بتنقية المحولات عن طريق وضع مستعمرات مفردة على أطباق بتر.