استخراج وتنقية الجلوبولات البلاستوبولية من بكتيريا التمثيل الضوئي

ابدأ بثقافة البكتيريا الزرقاء ، وهي بكتيريا التمثيل الضوئي.

تحتوي هذه البكتيريا على قطرات plastoglobul غنية بالدهون وأغشية الثايلاكويد ، وهي هياكل غشائية مطوية غنية بأصباغ التمثيل الضوئي.

قم بالطرد المركزي للثقافة وتخلص من المادة الطافية لإزالة السكريات خارج الخلية التي تنتجها البكتيريا. اغسل الحبيبات ، ثم أعد تعليقها في مخزن مؤقت.

استخدم مجانسا عالي الضغط لتوليد قوة القص ، مما يعطل جدران الخلايا والأغشية.

يؤدي تمزق أغشية الثايلاكويد إلى إطلاق أصباغ التمثيل الضوئي في المحلل. يتسبب إطلاق الصباغ في تغيير اللون الذي يشير إلى اضطراب الخلية وإطلاق الجلوبول البلاستي.

قم بتحميل المحلل في أنابيب الطرد المركزي ، ثم أضف محلول السكروز لتشكيل تدرج كثافة.

جهاز طرد مركزي لفصل المكونات الخلوية حسب الكثافة.

الثايلاكويد والمكونات الثقيلة الأخرى بيليه في الأسفل, بينما تطفو الكريات البلاستوبولية منخفضة الكثافة إلى الأعلى كشريط مميز.

اجمع جزء الجلوبول البلاستوبولي وقم بتخزينه عن طريق التجميد لمزيد من التحليل.

ازرع 50 مل من أنواع synechocystis PCC 6802 في وسائط BG11 لمدة 7 إلى 10 أيام للوصول إلى المرحلة الثابتة.

باستخدام مقياس الطيف الضوئي ، اضبط كثافة الخلية على كثافة بصرية تبلغ 2.0 عند 750 نانومتر. لإزالة السكريات ، قم بالطرد المركزي 50 مل من الثقافة وإزالة المادة الطافية. كرر غسل الخلايا في 50 مل من المخزن المؤقت A مرتين.

أعد تعليق الحبيبات المغسولة في 25 مل من المخزن المؤقت A وكسر الخلايا باستخدام خلية ضغط فرنسية عند 1,100 رطل بوصة مربعة. كرر العملية ثلاث مرات في الظروف الباردة حتى يتغير اللون المتحلل من الأخضر إلى الأحمر والأزرق والأخضر تحت الضوء الأبيض. قم بإزالة حصة تجانس الخلية وضعها جانبا ليتم تخزينها كعينة خلية إجمالية تمثيلية.

وزع المتجانس الناتج في ثمانية أنابيب طرد مركزي فائقة سعة ثلاثة ملليلتر مملوءة بحد أقصى 2.5 ملليلتر في كل أنبوب. تراكب هذا المتجانس مع 400 ميكرولتر من R المتوسط ، مما ينتج عنه تدرج خطوة. قم بموازنة الأنابيب بعناية عن طريق إضافة وسط R إضافي حسب الضرورة قبل طرد الأنابيب بالطرد.

تظهر الثايلاكويد والعضيات الأثقل الأخرى ، بما في ذلك أي أجسام بولي هيدروكسي ألكانوات ، تكوين حبيبات ، بينما تشكل الجلوبولات البلاستوكولية وسادة زيتية صفراء على الجزء العلوي من تدرج السكروز أو بالقرب منه. احصد الوسادة العائمة الناتجة من الكلويات الأرضية الخام بحقنة وقم بإيداع الحصاد في أنبوب سعة ملليلتر.

اكشط الكريات البلازمة من جانب جدار أنبوب الطرد المركزي الفائق بطرف إبرة إذا لزم الأمر. إما أن تستمر في معالجة البكتيريا الزرقاء أو تخزن الكريات الصوفية الخام عند 80 درجة مئوية تحت الصفر وتنقيتها لاحقا.