JoVE Encyclopedia of Experiments
علم الأحياء الدقيقة
0 مشاهدات • 4:37 د • October 30th, 2025
خذ ثقافة Phormidium lacuna ، وهي بكتيريا زرقاء خيطية.
قم بتجانس الثقافة لتفريق الخيوط ، ثم جهاز طرد مركزي لحبيبات البكتيريا.
تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في وسائط غنية بالمغذيات.
أضف الحمض النووي البلازميد الذي يحتوي على بروتين فلورسنت أخضر وجينات مقاومة للمضادات الحيوية على لوحة أجار مكملة بالمضادات الحيوية.
أضف المعلق البكتيري فوق الحمض النووي واحتضنه في ظل ظروف الإضاءة.
تستوعب البكتيريا الحمض النووي باستخدام النوع الرابع. تندمج الجينات التي تم إدخالها في إحدى النسخ المتعددة من الجينوم البكتيري.
أعد توزيع البكتيريا على لوحة أجار مكملة بالمضادات الحيوية لاختيار البكتيريا المحولة.
تحت المجهر الضوئي ، حدد الخيوط الخضراء السليمة التي تشير إلى التحول الناجح.
نقل الخيوط المختارة إلى وسائط سائلة ذات تركيز أعلى من المضادات الحيوية لإثراء السكان المحولين.
مرة أخرى ، ضعها على أجار بمستويات أعلى من المضادات الحيوية لفصل المحولات.
تصور تعبير GFP تحت مجهر مضان لتأكيد التحول الناجح.
ابدأ بتلقيح 50 مل من السائل F2 وسط في كل من قارورتين سعة 250 ملليلتر بمليلتر واحد من خيوط P. lacuna من ثقافة جارية. تزرع في الضوء الأبيض تحت التحريض لمدة خمسة أيام عند 25 درجة مئوية.
بعد خمسة أيام ، قم بتجانس 100 مل من تعليق الخلية P. lacuna عند 10,000 دورة في الدقيقة لمدة ثلاث دقائق وقياس الكثافة البصرية عند 750 نانومتر. ثم قم بالطرد المركزي لتعليق الخلية لمدة 15 دقيقة عند 6,000 مرة جم. قم بإزالة المادة الطافية الحبيبات في 800 ميكرولتر من السائل المتبقي ووسط F2 + الإضافي. خذ ثماني ألواح أجار F2 + Bacto تحتوي على 120 ميكروغراما لكل مليلتر من كانامايسين وماصة 10 ميكروغرام من الحمض النووي في منتصف كل صفيحة أجار.
على الفور ماصة 100 ميكرولتر من تعليق الخلية فوق الحمض النووي. احتفظ بلوحة الأجار بدون غطاء على المقعد النظيف للسماح للسائل الزائد بالتبخر. أغلق الطبق وقم بزراعته في الضوء الأبيض عند 25 درجة مئوية لمدة يومين.
بعد يومين ، قم بتوزيع خيوط كل صفيحة أجار على عدة ألواح أجار F2 + Bacto جديدة تحتوي على 120 ميكروغراما لكل مليلتر كانامايسين مع حلقة تلقيح. ازرع الصفائح في الضوء الأبيض عند 25 درجة مئوية وتحقق من الثقافات بانتظام تحت المجهر. بعد 14 إلى 28 يوما ، حدد الخيوط البنية الميتة وابحث عن الخيوط المحولة تحت المجهر.
تبدو الخيوط المحولة صحية وخضراء وتختلف عن الجزء الأكبر من الخيوط. انقل كل خيوط محولة إلى قوارير سعة 50 مليلترا مع 10 ملليلتر من F2 + وسط مع 250 ميكروغرام لكل مليلتر كانامايسين. تزرع في الضوء الأبيض عند 25 درجة مئوية على شاكر وراقب النمو لمدة تصل إلى أربعة أسابيع.
انقل الخيوط مرة أخرى إلى وسط أجار يحتوي على 250 ميكروغراما لكل مليلتر كانامايسين وانتظر حتى تنمو الخيوط. ثم قم بزيادة تركيز الكانامايسين مرة أخرى لتسريع عملية الفصل. بالنسبة لتعبير GFP ، يلاحظ خيوطا مفردة بمجهر مضان عند تكبير 40X أو 63X ويلتقط صورة إرسال المجال الساطع وصورة مضانة.