التعبير القابل للاستثناء لسم الريسين الموسوم بالهستيدين سلسلة A في الإشريكية القولونية
موسوعة JoVE للتجارب
علم الأحياء الدقيقة
0 مشاهدة • 2:57 دقيقة • November 28th, 2025
ابدأ بمستعمرات الإشريكية القولونية التي تحتوي على جين بوليميراز T7 منظم بواسطة مشغل اللاتيك وبلازميد تعبير.
يحمل البلازميد جينات مقاومة المضادات الحيوية وسلسلة سم الريسين A.
يتم التعبير عن جين المقاومة بشكل أساسي، منتجا بروتين مقاومة للمضادات الحيوية.
جين RTA موسوم بالهيستيدين ويتم تنظيمه بواسطة محفز T7 وعامل ال lac.
قم بتطعيم المستعمرات في وسط مضاد حيوي واحتضن الحركات بالرج.
يقوم بروتين مقاومة المضادات الحيوية بتعطيل المضاد الحيوي، مما يمكن من النمو الانتقائي للبكتيريا الحاملة للبلازميد.
انقل الثقافة إلى وسط مدعم بالمضادات الحيوية وحضن البكتيريا مع الرج لتعزيز نمو البكتيريا.
خفض درجة حرارة الزراعة لتعزيز طي بروتين RTA بشكل صحيح.
أضف محفزا لتخفيف كبت الشق. هذا يحفز تعبير بوليميراز T7، مما يبدأ نسخ RTA وتخليق البروتين.
جهاز طرد مركزي لجمع البكتيريا والتخلص من الفائق.
اغسله باستخدام جهاز تفريغ، وجهاز طرد مركزي، وأزل السوبرناتانت.
أعد تعليق البكتيريا التي تعبر عن RTA الموسومة بعلامة His في المخزن المؤقت.
ابدأ هذا البروتوكول بتحويل الخلايا كما هو موضح في البروتوكول النصي. قم بتلقيح خمسة ملليلتر من وسط الكاناميسين LB بخلايا تحتوي على بلازميد تعبير RTA أو الناقل الفارغ.
حضن الخلايا عند 37 درجة مئوية و220 دورة في الدقيقة لمدة 24 ساعة. أضف لتر واحد من وسط LB كانامايسين بخمسة ملليلتر من ما قبل الزراعة (
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية