عزل الأبواغ الداخلية من عينة بيئية عن طريق التحلل المستهدف للخلايا النباتية

خذ عينة بيئية تحتوي على خلايا نباتية وأبواغ داخلية لبكتيريا مكونة للأبواغ، إلى جانب بكتيريا أخرى.

تمتلك الأبواغ الداخلية طبقة واقية تساعدها على البقاء في الظروف الصعبة.

باستخدام وحدة ترشيح بالفراغ، يتم ترشيح العينة لحبس الخلايا والأبواغ الداخلية على غشاء.

ضع الغشاء في طبق وقطعه إلى قطع صغيرة.

انقل القطع إلى أنبوب، أضف حاجزا مؤقتا، وحرك الأنبوب لتحرير الخلايا والأبواغ الداخلية.

حضن بحركة على درجة حرارة عالية لإضعاف البنية الخلوية الخضرية دون الإضرار بالأبواغ الداخلية.

برد العينة، ثم أضف الليزوزيم وحضن القطعة مع التحريك. يقوم الليسوزيم باضطراب جدار الخلايا النباتية، مما يؤدي إلى تمزقها.

أضف هيدروكسيد الصوديوم ومنظف، وقم بالحضانة لتحلل الجزيئات الكبيرة والحطام الخلوي مع الحفاظ على الأبواغ الداخلية المرنة.

قم بترشيح العينة لعزل الأبواغ الداخلية. اغسل الأبواغ الداخلية لإزالة المواد الزائدة، وتجهيزها لمزيد من التحليل.

بمجرد تجهيز وحدة الترشيح ومضخة التفريغ وفقا لبروتوكول النص، استخدم ملقط معقم مشتعل بالإيثانول لإضافة غشاء نيتروسلولوز معقم إلى وحدة الترشيح. أضف نصف عينة الفائق التي تم تحضيرها للتو إلى وحدة ترشيح الغشاء واستخدم مضخة التفريغ لجمع الخلايا على الغشاء. عندما يمر السائل بالكامل عبر الفلتر، أوقف مضخة التفريغ.

استخدم ملقط معقم لإزالة الغشاء بعناية ووضعه في طبق بتري معقم. مع قطعة جديدة من الغشاء المعقم، كرر عملية الترشيح مع النصف المتبقي من المحلول. لفصل الأبواغ عن الخلايا النباتية في الكتلة الحيوية التي تم جمعها للتو، قم بإذابة الغشاء إذا كان مجمدا، واستخدم مقصا معقما مشتعلا باللهب الإيثانولي لتقطيعه إلى قطع أصغر.

انقل قطع الغشاء إلى أنبوب معقم بسعة 2 ملليلتر وأضف 900 ميكرولتر من مخزن TE 1X. اخلط جيدا عن طريق الدوامة لتحرير الكتلة الحيوية من الغشاء. حضن الأنبوب عند 65 درجة مئوية و80 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق.

ثم أزل الأنبوب من الحاضنة ودعه ليبرد لمدة 15 دقيقة. أضف 100 ميكرولتر من الليزوزيم الطازج إلى تركيز نهائي قدره ملليغرام لكل ملليلتر وحضن العينة عند 37 درجة مئوية و80 دورة في الدقيقة لمدة 60 دقيقة لتحليل الخلايا النباتية. بعد اكتمال التحلل، أضف 250 ميكرولتر من 3 هيدروكسيد الصوديوم العادي و250 ميكرولتر من محلول SDS بنسبة 6٪ إلى العينة. حضن على درجة حرارة الغرفة وبسرعة 80 دورة في الدقيقة لمدة 60 دقيقة.

بعد ذلك، جهز وحدة ترشيح معقمة تحمل أغشية بقطر 25 ملم عن طريق التعقيم الافتراضي. بعد أن تبرد وحدة الترشيح، ضع غشاء نيتروسلولز بقطر 25 ملم بقياس 0.2 ميكرومتر عليها.

أضف العينة إلى الغشاء واستخدم مضخة التفريغ لترشيح السائل، مما يجمع الأبواغ الداخلية على الغشاء، بينما تمر المادة النباتية الخلوية من خلاله.