انسداد التكاثر المضبط الموسوم بالفلورية في الإشريكية القولونية

خذ على سبيل المثال مزرعة الإشريكية القولونية المعدلة وراثيا تعبر عن مصفوفة مشغل رباعي الكروموسومات (tetO).

تحمل البكتيريا أيضا بلازميدا يحتوي على محفز محفز للأرابينوز يحفز التعبير عن بروتين مثبط تترا سايكلين الموسوم ب YFP.

انقل الزراعة إلى وسط مغذي غني يحتوي على مضادات حيوية، وحضن الزراعة مع الرج لاختيار الخلايا الحاملة للبلازميدات.

مع نمو الخلايا، تتكون الربيليسومات وتبدأ في تكرار الحمض النووي الكروموسومي.

في المرحلة الأسية، اجمع جزءا كعنصر تحكم غير محفز.

أضف الأرابينوز، وهو محفز، إلى الثقافة المتبقية وحضن كلتا الثقافتين بالرج.

في الثقافة غير المستحثة، يبقى الدايمر AraC مرتبطا بحلقة الحمض النووي، مما يثبط تعبير المثبط.

في الثقافة المستحثة، يرتبط الأرابينوز بدايمر AraC، مما يحفز تعبير المثبط.

ترتبط بروتينات المثبطات بمصفوفة التيتو الكروموسومي، مما يوقف تقدم شوكة التكرار.

استخدم المجهر الفلوري لمراقبة كلتا الزرعة.

تؤكد البؤر الفلورية في مزرعة الإشريكية القولونية المستحثة انسداد التكاثر بواسطة البروتين المثبط.

يستخدم سلالة إشريكية قولونية تحمل مصفوفة مشغل تتراسيكلين في بلازميد pKM1 لهذا الإجراء. يشفر pKM1 لجهاز TetR-YFP، وهو بروتين فلوري أصفر محفز وموسوم ببروتينات تتراسيكلين.

قم بتخفيف مزرعة جديدة ليلا من هذا السلالة من الإشريكية القولونية إلى كثافة بصرية عند 600 نانومتر من 0.01 في وسط مخفف ومعقد مع المضادات الحيوية اللازمة للاختيار. نما الزراعة عند درجة حرارة 30 درجة مئوية مع الرج إلى كثافة بصرية عند 600 نانومتر من 0.05 إلى 0.1. أزل عينة بحجم 10 مليليتر لتكون التحكم غير المحفز.

أضف 0.01٪ أرابينوز إلى الثقافة المتبقية لتحفيز إنتاج TetR-YFP من pKM1. استمر في نمو كل من الزراعة غير المحفزة والمحفزة عند درجة حرارة 30 درجة مئوية مع الرج. بعد ساعة واحدة، تحقق من وجود نقطة تركيز واحدة داخل كل خلية من الزراعة المستحثة باستخدام المجهر الفلوري.

إذا تم تأكيد حجب الخلايا المستحثة، وهو ما يشير إلى أن أكثر من 70٪ من الخلايا لها تركيز واحد، قم بتسجيل الكثافة البصرية وإزالة 7.5 ملليلتر من العينة للتحليل بواسطة الرحلان الكهربائي الهلامي ثنائي الأبعاد. إزالة عينة مكافئة من الثقافة الضابطة غير المستحثة.