JoVE Encyclopedia of Experiments
علم الأحياء الدقيقة
0 مشاهدات • 2:48 د • November 28th, 2025
خذ على سبيل المثال خلطة رئيسية تحتوي على بوليميراز DNA يزاحف الخيوط، ونوكليوتيدات، وصبغة ثنائية السلسلة مرتبطة بالحمض النووي للتضخيم الإيزوثيراري الوسيط بالحلقة أو LAMP.
أضف بادئات تحتوي على تسلسل مكمل عكسي خاص بالجين البكتيري المستهدف.
وزع الخليط الرئيسي في الأنابيب.
أضف عينات تحتوي على قوالب الحمض النووي البكتيري إلى الأنابيب.
ضع الأنابيب داخل آلة LAMP الكهربائية.
يسمح الإزالة الأولية للبرايمر بالارتباط بالحمض النووي المستهدف.
عندما يبدأ بوليميراز DNA الذي يزاحف الخيط في تخليق خيط جديد، فإنه يزيح الخيط الموجود، مما يلغي الحاجة إلى الدورة الحرارية.
يشكل حاصل الضرب المضخم بنية حلقية بسبب الاقتران العكسي المكمل.
يحتوي هذا الهيكل على عدة مواقع بدء للدورة التالية، مما يسهل التضخيم الأسي للحمض النووي المستهدف.
ترتبط الصبغة بالحمض النووي المضخم وتصدر فلورة.
راقب الفلورة في الوقت الحقيقي للكشف عن وجود الجين البكتيري المستهدف في العينات.
افصل فعليا المناطق المستخدمة لتحضير خليط LAMP Master وإضافة قوالب الحمض النووي.
نظف أسطح العمل باستخدام الإيزوبروبانول ومحلول تحليل الحمض النووي وDNase. ثم نظف الماصات وحوامل شرائط الأنابيب. قم بإذابة خليط الماستر إيزوثيرمال، وخليط برايمر 10X، وماء من الدرجة الجزيئية، وحمض نووي متحارب إيجابي، وقوالب الحمض النووي في درجة حرارة الغرفة.
شغل جهاز LAMP وأدخل المعلومات العينة ذات الصلة. جهز خليط LAMP الرئيسي وفقا لتعليمات المخطوطة، ثم قم بتدوير الدوامة والطرد المركزي لفترة وجيزة، وتوزيع 23 ميكرولتر من الماستر ميكس في كل بئر من شريط الأنابيب. قم بعمل فورتكس لجميع قوالب الحمض النووي وقم بتحويلها للطرد المركزي لفترة وجيزة.
ثم أضف ميكرولترين من قالب الحمض النووي إلى البئر المناسب، وأغلق البئر بإحكام. أزل شريط الأنبوب من الحامل، وحركه للتأكد من تجمع جميع المواد في أسفل الأنبوب. قم بتحميل شريط الأنبوب في جهاز LAMP وابدأ تشغيل LAMP التشغيلي.
أثناء تفاعل LAMP أثناء التفاعل، اضغط على علامات التبويب Temperature وEmplification وAnneal لرؤية التغيرات الديناميكية في مختلف المعلمات أثناء تشغيل LAMP التفاعلي.