استخراج الحمض النووي الجينومي من أنسجة أوراق النبات المصابة بالبكتيريا الممرضة

خذ ورقة مصابة ببكتيريا كانديداتوس ليبريباكتر، وهي بكتيريا ممرضة.

قم بتقطيعه إلى قطع، وتجميده بسرعة في النيتروجين السائل، وطحن الخلايا النباتية وإطلاق محتوياتها، بما في ذلك البكتيريا.

أضف محلول تحلل النوى وامزج جيدا.

حضن على درجة حرارة عالية لتحلل الأغشية، مما يطلق الحمض النووي الجيني من نوى النباتات والخلايا البكتيرية.

أضف إنزيم RNase، ثم قلب الأنبوب ليخلط، ثم حضن لتحليل الحمض النووي الريبي.

أضف محلول ترسيبي للبروتين وامزجه لتعزيز تجمع البروتين. الطرد المركزي إلى بروتين الحبيبات والحطام الخلوي.

انقل المادة الفائقة إلى أنبوب يحتوي على الأيزوبروبانول وامزج الحمض النووي لترسيب الحمض النووي إلى خيوط مرئية. جهاز طرد مركزي لاستبعاد الحمض النووي.

اغسل الحبيبة بالإيثانول لإزالة الشوائب، وجففها في الهواء، وترطيب الحمض النووي.

حضن العينة عند درجة حرارة عالية لإذابة الحمض النووي، ثم تحميل عينة في ميكروكوفيت.

باستخدام مقياس الطيف الضوئي، قس تركيز الحمض النووي المعزول.

أولا، استخدم مقصا نظيفا لقطع ورقة طازجة كاملة من شجرة حمضيات، وضعه في كيس ساندويتش بلاستيكي نظيف. ثم قم بتبريد الهاون والمدقة بإضافة كمية صغيرة من النيتروجين السائل. بعد ذلك، استخدم المقص لقطع قطع صغيرة من نسيج الورقة، بحجم يقارب بوصة مربعة واحدة.

ضع قطع الأوراق في الهاون لتجميدها فورا. ابدأ بسرعة في طحن نسيج الورقة بالهاون حتى يتبخر النيتروجين السائل، ويبقى مسحوق أخضر ناعم. بعد ذلك، برد ملعقة معدنية في النيتروجين السائل لمدة 10 إلى 15 ثانية. ثم استخدم الملعقة الباردة لسحب الأنسجة الأرضية من الهاون في أنبوب طرد مركزي دقيق بسعة 1.5 ملليلتر.

استخدم ماصة بسعة 1000 ميكرولتر لإضافة 600 ميكرولتر من محلول تحلل النوى إلى العينة. ثم قم بتدوير العينة لمدة ثانية إلى ثلاث ثوان. حضن الأنبوب عند درجة حرارة 65 درجة مئوية، في حمام مائي لمدة 15 دقيقة.

بعد انتهاء فترة الحضانة، استخدم ماصة بسعة 10 ميكرولتر لإضافة 3 ميكرولتر من محلول RNase إلى الليزات لإزالة RNA. ثم اخلط محتويات الأنبوب عن طريق قلبه مرتين إلى خمس مرات.

حضن عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة في حاضنة الخزانة. بعد 15 دقيقة، أضف 200 ميكرولتر من محلول ترسيب البروتين إلى العينة. قم بتدوير الأنبوب بسرعة عالية لمدة 20 ثانية. بعد ذلك، قم بعمل الطرد المركزي للعينة عند 13000 جرام لمدة ثلاث دقائق.

خلال عملية الطرد المركزي، أضف 600 ميكرولتر من الأيزوبروبانول محفوظا في درجة حرارة الغرفة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد بسعة 1.5 ملليتر. بعد انتهاء الطرد المركزي، قم بإزالة المادة الفائقة بحذر من أنبوب الطرد المركزي إلى الأنبوب الذي يحتوي على الأيزوبروبانول. تخلص من الحبيبة.

اقلب الأنبوب ليكون الحمض النووي مرئيا، مثل خيط يشبه الخيط. بعد ذلك، قم بعمل طرد مركزي على العينة عند 13000 جرام لمدة دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

أخرج المادة الفائقة بعد الطرد المركزي. ثم أضف 600 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 70٪ إلى الحبيبة. اقلب الأنبوب عدة مرات لغسل الحبيبة.

قم بعمل طرد مركزي للأنبوب عند 13000 جرام لمدة دقيقة واحدة. بعد انتهاء الطرد المركزي، استنشق السوبرناتانت بحذر. ثم قلب الأنبوب مع فتح الغطاء على ورق ماص ليجف في الهواء لمدة 15 دقيقة.

بعد التجفيف، أضف 100 ميكرولتر من محلول إعادة ترطيب الحمض النووي إلى الحبيبة. حضن تعليق الحمض النووي عند 65 درجة مئوية في حمام مائي لمدة ساعة. انقر على الأنبوب بشكل دوري أثناء الخلط.

أضف 1 ميكرولتر من الماء النقي في ميكرو-كوفيت. اقرأ الماء كأنه فارغ على جهاز الطيف الفوتوميتري. ثم أضف 1 ميكرولتر من العينة في الميكروكوفيت. ضع الميكروكوفيت على مقياس الطيف الضوئي، واحصل على تركيز الحمض النووي.