قياس الكمي GLUT4 إزفاء إلى غشاء البلازما التي التدفق الخلوي

الهدف العام من هذا الإجراء هو الكشف عن انتقال GLUT4 إلى الغشاء البلازمي لخلايا الثدييات استجابةً للتعرض للإنسولين. يتم أولاً زراعة أرومات عضلية مجوعة المصل، والتي لا تمتلك سوى بروتين GLUT4 داخل الحويصلات، في طبق زراعة ذي 24 بئراً. ثم يُضاف إلى الخلايا جسم مضاد ضد حاتمة خارجية لـ GLUT4، يكون قد تم تحضينه مسبقاً مع جسم مضاد ثانوي مقترن بفلور، يليه إضافة الإنسولين.

يؤدي ارتباط مستقبلات الإنسولين على سطح الخلايا إلى انتقال GLUT4 إلى سطح الغشاء البلازمي. بعد ذلك، يتم التعرف على GLUT4 بواسطة الأجسام المضادة الموجودة في الوسط. وفي هذه المرحلة، يمكن تثبيت الخلايا وقياس شدة الصبغ الفلوري باستخدام قياس التدفق الخلوي.

يمكن استخدام هذه الطريقة لدراسة انتقال ggl four وأيض الجلوكوز، كما يمكن تطبيقها على أنظمة أخرى مثل إخراج حبيبات الخلايا القاتلة الطبيعية (NK cell) من خلال كشف CD 1 0 7 A عند الغشاء. وبالنسبة لهذا الإجراء، من المهم استخدام خلايا في حالة نمو نشط أو بنسبة تلاحم تبلغ 60 إلى 80%، وأن تكون قد خضعت للتجويع من المصل طوال الليل. بعد حصاد الخلايا باستخدام التربسين، اغسلها وأعد تعليقها في وسط نمو عادي بتركيز 200, 000 خلية لكل ملليلتر، ثم وزع الخلايا في طبق ذي 24 بئراً بمعدل 0.1 مليون خلية لكل 500 microliters في البئر الواحد. بعد ذلك، حضن الخلايا لمدة ساعة واحدة عند 37 °C للسماح للخلايا بالتعافي من تأثير التربسين.

وفي هذه الأثناء، اخلط الجسم المضاد الأولي anti-gliadin 4 والجسم المضاد الثانوي chicken anti-goat IgG المقترن بـ Alexa Fluor 488 بنسبة 5 إلى 1، واحسب الحجم النهائي المطلوب، مع مراعاة استخدام 10 µL من خليط الأجسام المضادة لكل بئر. حضّن خليط الأجسام المضادة لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة وفي الظلام، وأثناء فترة تحضين خليط الأجسام المضادة، قم بتحضير مخزون عمل بتركيز مضاعف مرتين من الأنسولين عن طريق تخفيفه إلى التركيز المطلوب في وسط النمو.

بمجردما تكتمل فترة تحضين الخلايا لمدة ساعة واحدة، أخرجها من المحضنة. أضف بلطف 10 µL من محلول الأجسام المضادة إلى كل بئر يحتوي على خلايا. تأكد من ترك بئر واحد على الأقل بدون صبغ.

ستُستخدم هذه العينة السالبة لاحقاً لضبط جهاز قياس التدفق الخلوي. بعد ذلك، أضف 500 µL من المخزون المركز من الإنسولين بتركيز ضعفين إلى كل بئر لتحفيز انتقال GLUT4 إلى سطح الخلية، ثم حضن الطبق لمدة 30 دقيقة عند 37 °C في الظلام. بعد إخراج الخلايا من الحضانة، قم بتثبيتها بإضافة 1 mL من PBS 1%PFA إلى كل بئر وحضن الطبق لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. باستخدام رافع الخلايا، افصل الخلايا المثبتة بلطف من قاع الآبار وانقلها من كل بئر إلى أنبوب FACS منفصل.

قم بطرد الأنابيب مركزياً لترسيب الخلايا، ثم استخدم جهاز هزاز Vortex وأعد تعليقها في 1 mL من PBS لغسل الخلايا وطردها مركزياً مرة أخرى، وكرر عملية الغسل هذه مرتين، مع التخلص من السائل الطافي بين عمليات الغسل.

أخيراً، أعد تعليق الخلايا المغسولة في 400 microliters من PBS 1%PFA. يمكن الآن تحليل الخلايا للكشف عن التعبير السطحي لـ glute four باستخدام جهاز قياس التدفق الخلوي. وبمجرد وصولك إلى جهاز قياس التدفق الخلوي مع عيناتك، ابدأ في الحصول على البيانات من العينة الضابطة غير المصبوغة.

حدِّد بوابة واسعة للخلايا الحية باستخدام معلمات التشتت الأمامي والجانبي. ثم اضبط إعداد الجهد لقناة FL one بحيث تكون الذروة السالبة مرئية ضمن هوامش المخطط التكراري. بمجرد ضبط هذه المعلمات، قم بتشغيل كل عينة تجريبية مع تسجيل ما لا يقل عن 10,000 حدث حي لكل أنبوب.

يُظهر هذا المدرج التكراري زيادة تنظيم صبغ Glut4 السطحي في الخلايا العضلية التي تعرضت لـ 0 أو 1 أو 10 أو 100 nanomolar من الإنسولين. وفي المقابل، تفشل الخلايا العضلية المأخوذة من أفراد يعانون من مقاومة الإنسولين في زيادة تنظيم Glut4 استجابةً لـ 100 nanomolar من الإنسولين. وإذا تم تطبيع متوسط شدة الفلورية للخلايا المحفزة بالنسبة للخلايا غير المحفزة، يصبح من الممكن مقارنة قيم MFI للخلايا العضلية السليمة وتلك المقاومة للإنسولين بشكل مباشر.

باستخدام هذا الإجراء، يمكن صبغ الخلايا بعلامات إضافية سطحية أو داخل خلوية لتحديد المجموعات الفرعية المختلفة من الخلايا في المجتمعات الخلوية المختلطة.