التهجين الفلوري في الموقع لبكتيريا الأمعاء في مقاطع أمعاء الفئران

ابدأ بإضافة محلول يحتوي على مجسات التهجين الفلوري في الموقع (FISH) الخاصة ببكتيريا 16S rRNA إلى شريحة تحتوي على مقاطع أمعاء الفأر التي استعمرتها البكتيريا.

ضع غطاء لنشر المجسات السائلة ومنع التبخر.

حضن السلايد في غرفة رطبة عند درجة حرارة مرتفعة.

هذا يفتح البنية الثانوية للحمض النووي الريبي، مما يسهل تهجين المسبار مع التسلسلات التكميلية في الحمض النووي البكتيري 16S rRNA.

أزل الغطاء واحتضن الشريحة في مخزن غسيل مسخن مسبقا لإزالة المجسات غير المربوطة.

اشطف بمحلول فوسفات للحفاظ على الرقم الهيدروجيني الفسيولوجي.

ضع صبغة مضادة تحتوي على صبغة خاصة بالمخاط وصبغة نووية، ثم حضنها.

ترتبط هذه الأصباغ بشكل انتقائي بالمخاط المعوي وبحمض نووي لخلايا البكتيريا والمضيف. اغسل السلايد باستخدام مخزن مؤقت وثبت أغطية الغطاء على الشريحة باستخدام وسائط التثبيت.

تحت المجهر الكونفوكلي، راقب البكتيريا الموسومة ب FISH، وخلايا الأمعاء، وطبقة المخاط داخل المقاطع.

أنشئ دوائر متقاربة جدا حول كل قسم من الأنسجة باستخدام حاجب سائل أو قلم PAP للحد من مساحة التمدد التي يجب تغطيتها بمحلول التهجين، وتجنب ملامسة الحبر للقسم.

جهز محلول التهجين وأضف 0.5 ميكروغرام من المجس لكل 50 ميكرولتر من المحلول المستخدم. قم بطباعة المحلول على الأقسام الموجودة في الشريحة. غطى القسم بأغطية بلاستيكية مرنة، لضمان أن حجم السائل المستخدم يغطي القسم بأكمله.

أنشئ غرفة رطبة باستخدام صندوق ماصات مع مناديل أو مناديل ورقية تم نقعها بمحلول هجين زائد أو PBS لتوفير الرطوبة. حضن السلايد في الحجرة الرطبة عند 45 إلى 50 درجة مئوية لمدة لا تقل عن ثلاث ساعات حسب المجس لتقليل التبخر. أزل أغطية البلاستيك، وحضن الشرائح في مخزن غسيل FISH داخل جرة Coplin، وكلاهما مسخن مسبقا إلى 50 درجة مئوية.

ضع جرة كوبلين مرة أخرى في فرن درجة حرارة 50 درجة مئوية لمدة 10 إلى 20 دقيقة. أزل مخزن غسيل FISH واستبدله ب PBS في جرة Coplin. مباشرة بعد إعادة ملء جرة كوبلين ب PBS، قم بإخراج PBS.

أزل الشرائح من البرطمان والصق الصبغة العكسية على الجزء بأكمله، مع التأكد من عدم لمس المنديل برأس الماصة. حضن عند 4 درجات مئوية لمدة 45 دقيقة. اغسل البقع ثلاث مرات بسرعة باستخدام PBS الطازج.

امسح خلف الشرائح بمناديل أو منشفة ورقية ودع معظم PBS يتبخر من الأقسام بمساعدة خط تفريغ متصل بطرف ماصة. قم بتركيب الأقسام باستخدام وسيط تركيب. ثبت الغطاء على الشريحة عن طريق الطلاء على حواف الغطاء بطلاء أظافر شفاف، مع الحرص على الابتعاد عن حافة الشريحة. دعها تثبت في درجة حرارة الغرفة.