JoVE Encyclopedia of Experiments
علم الأحياء الدقيقة
0 مشاهدات • 3:04 د • January 30th, 2026
ابدأ بزراعة بكتيريا ليجيونيلا الرئوية، وهي بكتيريا سالبة جرام ممرضة تطلق الحويصلات الغشائية الخارجية.
تحمل هذه المركبات العضلية الدهنية البوليسكاريدية وبروتينات الغشاء التي تساهم في ضراوة البكتيريا.
قم بعمل طرد مركزي للزراعة لإزالة البكتيريا السليمة.
اجمع المادة الفائقة التي تحتوي على OMVs والطرد المركزي مرة أخرى إلى البكتيريا المتبقية من الحبيبات.
قم بترشيح المادة الفائقة عبر غشاء لإزالة البكتيريا المتبقية مع الاحتفاظ ب OMVs.
قم بإجراء ترشيح ثان باستخدام غشاء جديد لإزالة الحطام البكتيري.
اجمع الفلترة الخالية من البكتيريا وقم بعمل الطرد المركزي فوق الفائق لإطلاق الميكروفونات الخارجية.
تخلص من السوبرناتان، وأعد تعليق الحبيبة في الحافظة، ثم قم بعمل الطرد المركزي الفائق مرة أخرى لإزالة البروتينات والدهون البوليسكاريدية المرتبطة بشكل فضفاض.
أزل الفائق وأعد تعليق الميكروفونات النقية في المخزن المؤقت.
انقل مجموعة من OMVs على ألواح أجار الدم وBCYE واحتضن.
عدم وجود تكوين مستعمرات يؤكد غياب التلوث البكتيري.
تخزين المركبات الخارجية المتعددة على درجة حرارة منخفضة لدراسات تفاعل المضيف مع الممرض.
أضف الثقافة السائلة المتبقية إلى 90 ملليلتر من وسط YEB الطازج وحضن الثقافة على شاكر دوار حتى تصل إلى OD600 من 3.0 إلى 3.5. قم بعمل طرد مركزي في الزراعة السائلة بوزن 4000 جرام لمدة 20 دقيقة لإزالة البكتيريا. ثم انقل المادة الفائقة إلى أنابيب الطرد المركزي الطازجة.
تخلص من الحبيبات البكتيرية وقم بالطرد المركزي على العينات مرة أخرى قبل تكرار خطوة الطرد المركزي مرة أخرى. بعد ذلك، قم بتعقيم الفائق المتبقي مرتين بالفلتر.
ثم نقل المادة الفائقة الخالية من البكتيريا إلى أنابيب الطرد المركزي فوق الفائق وتدوير العينات على حرارة 100,000 جرام في 4 درجات مئوية لمدة 3 ساعات. أخرج السوبرناتينت وتخلص منه. ثم استخدم PBS المعقم لإعادة تعليق حبيبات OMV وتجميعها.
كرر خطوة الطرد المركزي فوق الفائق لإزالة البروتينات الملوثة وLPS الحرة. الآن، تخلص من المادة الفوقية وجفف أنبوب الطرد المركزي فوق الفائق باستخدام مسحة قطنية معقمة. أعد تعليق حبيبة OMV مع 500 ميكرولتر من PBS المعقمة.
ثم ضع 20 ميكرولتر على كل من صفائح أجار الدم وألواح BCYE لتجنب التلوث البكتيري في الحويصلة المحضرة. حضن صفيحة الأجار الدموية طوال الليل وصحيحة الأجار BCYE لمدة 3 أيام.