اكتشاف التعبير الجيني المستهدف في دماغ فأر مصاب بالبكتيريا

خذ إجمالي الحمض النووي الريبي المستخرج من دماغ فأر ملوث ببكتيريا ممرضة. يحتوي المستخلص على نصوص من جينات مستجابة للعدوى.

أضف إنزيما يحلل الحمض النووي ويحتضن لتحليل الحمض النووي الجيني المتبقي.

أضف خلطة رئيسية تحتوي على إنزيم الإنزيم العكسي (RT)، والنوكليوتيدات، والبادئات غير المحددة.

الحضانة لتخليق الحمض النووي المكمل (cDNA).

أدخل درجة حرارة عالية لتعطيل إنزيم RT.

خذ على سبيل المثال مزيج رئيسي يحتوي على بوليميراز DNA، ونيوكليوتيدات، وصبغة مزدوجة السلسلة مرتبطة بالحمض النووي، وبادئات خاصة بالجين المستهدف.

أضف cDNA وطبق الحرارة لتغيير طبيعة الحمض النووي.

يرتبط البرايمر ب cDNA المستهدف، مما يمكن من تخليق خيوط DNA جديدة.

تتكرر الدورة لتضخيم الجين المستهدف.

يرتبط الصبغة بالحمض النووي المضخم ويصدر فلورة، والذي يسجل في نهاية كل دورة.

تؤكد زيادة الفلورة تعبير الجين المستجيب للعدوى في دماغ الفأر المصاب.

إصابة جميع الفئران باستخدام خلايا العوالق أو خلايا حالة الأغشية الحيوية وإجراء القتل الرحيم كما هو موضح في البروتوكول النصي. بعد ذلك، استخلاص الحمض النووي الريبي الكلي من نسيج الدماغ باستخدام مجموعة استخراج RNA.

لكل فأر، استخدم نسيج دماغ كامل لاستخراج RNA. قسم أنسجة الدماغ بالكامل إلى خمسة أنابيب. خذ حتى 100 ملليغرام من نسيج الدماغ وأضف 1 ملليتر من محلول التحلل إلى كل أنبوب يحتوي على مصفوفة التحلل التي توفرها الطقم.

استخرج الحمض النووي الريبي باتباع الخطوات المذكورة في بروتوكول النص. بعد ذلك، قم بإجراء تخليق الحمض النووي الكيميائي، بما في ذلك إزالة الحمض النووي الجيني، باستخدام جهاز تدوير حراري مع مجموعة كاشف نسخ عكسي. أضف 1 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي إلى أنبوب يحتوي على 2 ميكرولتر من 5x من محلول إزالة الحمض النووي الجينومي و1 ميكرولتر من إنزيم إزالة الحمض النووي الجيني.

أضف ماء خال من RNase حتى يصل الحجم إلى 10 ميكرولتر. حضن لمدة دقيقتين عند 42 درجة مئوية. أضف 10 ميكرولتر من خليط الماستر إلى محلول التفاعل ثم اخلط بلطف.

تابع فورا في تفاعل النسخ العكسي بوضع الأنبوب عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. ثم انقل التفاعل إلى 85 درجة مئوية لمدة 5 ثوان. قم بإجراء التحليل الكمي لفحص PCR في الوقت الحقيقي باستخدام جهاز PCR في الوقت الحقيقي مع مجموعة PCR كمي في الوقت الحقيقي السيبراني. باتباع تعليمات المجموعة، اجمع بين الإنزيم، البرايمر، صبغة ROX المرجعية 50x الثانية، وقالب cDNA. ثم أضف ماء خال من RNase حتى يصل إجمالي الحجم إلى 20 ميكرولتر.

شغل كل عينة في ثلاث نسخ باستخدام المعلمات الحرارية المدرجة في بروتوكول النص وحساب التغير النسبي في الطي بناء على طريقة CT بمقدار 2 ناقص دلتا دلتا.