اختبار التسلل المشترك لفحص مؤثرات الممرضين التي تثبط كتم الحمض النووي الريبي النباتي

خذ خليطا يحتوي على أحجام متساوية من تعليقين Agrobacterium tumefaciens ، كل منهما يحمل بلازميد-أحدهما يشفد GFP، والآخر يشفر بروتين مؤثر.

اثقب ثقبا واستخدم حقنة بدون إبر لإدخال الخليط إلى السطح السفلي لأوراق نيكوتيانا بنثاميانا 16c الصحية والمتوسعة بالكامل.

قم بمسح أي تعليق زائد بالأنسجة الرخوة لمنع نمو البكتيريا بشكل مفرط.

حدد المناطق المتسللة وحضن النباتات في ظروف نمو مثالية.

تقوم الزراعة الباكتيريوم بنقل الحمض النووي البلازميدي إلى خلايا النبات، حيث يتم نسخ جينات GFP والمؤثر إلى mRNA وترجمتها إلى بروتينات.

يستخدم نظام الدفاع في المصنع كتم الحمض النووي الريبي، حيث يتم تحميل siRNA مزدوج في RISC. يتم إزالة خيط الراكب، ويوجه الدليل المجمع لتحلل mRNA GFP المستهدف.

ومع ذلك، ترتبط البروتينات المؤثرة ب siRNAs، مما يمنع ارتباطها ب RISC ويسمح باستمرار فلورة GFP.

وهذا يمكن من تحديد عوامل ممرضة تثبط كتم الحمض النووي الريبي للنباتات.

اخلط كميات متساوية من مزرعة أجروبكتيريوم تحتوي على بروتين فلوري أخضر 35S مع مزرعة Agrobacterium تحتوي على 35S كبح فيروس فسيفساء الخيار 2b، أو مؤثر محتمل، أو ناقل فارغ. باستخدام حقنة بدون إبر بسعة 1 ملليلتر، قم بتسلل بحذر وببطء إلى معلقات البكتيريوم المختلطة على الجوانب الخلفية لأوراق نيكوتيانا بيثاميانا 16c.

أزل التعليق البكتيري المتبقي من الأوراق باستخدام مناديل الأنسجة الرخوة، وقم بتدوير حواف البقع المتغلغلة بقلم تحديد حول حواف البقع المتسللة.