التقييم الصناعي لقتل البكتيريا بواسطة الخلايا البلعمية الطحالية للفئران الوليدة

ابدأ بتفكيك ميكانيكي طحال الفئران حديثي الولادة لتوليد تعليق خلية واحدة.

انقل التعليق إلى أنبوب، جهاز طرد مركزي، وأخرج السوبرناتانت.

أعد تعليق الحبيبة في حاجز التحلل للقضاء على الكريات الحمراء.

أضف المخزن المؤقت والطرد المركزي مرة أخرى، وأزل السوبرناتانت.

أعد تعليق الخلايا في المخزن واحتضن بحبيبات مغناطيسية مغطاة بالأجسام المضادة تستهدف مستقبلا يعبر عنه على العدلات والخلايا الأحادية الالتهابية.

استخدم جهاز الطرد المركزي وإزالة الخرزات غير المربوطة. أضف المخزن المؤقت (buffer)، ثم مرر التعليق عبر عمود مغناطيسي حديدي وطبق مجالا مغناطيسيا للحفاظ على الخلايا المرتبطة بالخرز.

قم بإزالة المجال المغناطيسي، وسحب الخلايا باستخدام المخزن الكهربائي، وزرعها في صفيحة متعددة الآبار.

أضف تركيزات متزايدة من البكتيريا المتوهجة إلى الآبار المختارة.

حضانة للسماح للعدلات والخلايا الأحادية باستيعاب البكتيريا عن طريق البلعمة.

استبدل الوسط بوسط يحتوي على مضادات حيوية للقضاء على البكتيريا غير المداخلة.

تسجيل التلميع على فترات منتظمة لتقييم استيعاب البكتيريا والقتل اللاحق الناتج عن البلعمة.

لإجراء اختبار قتل البكتيريا في المختبر، ضع الطحال غير المصاب في مصفاة نايلون بحجم 40 ميكرومتر داخل طبق بتري معقم بقطر 60 ملم يحتوي على 5 ملليلتر من PBS مع 10٪ مصل بقري جنيني، واستخدم مكبس حقنة معقمة بسعة 3 ملليلتر لتفكيك الأنسجة إلى تعليق خلوي واحد. انقل الخلايا إلى أنبوب طرد مركزي بسعة 15 ملليلتر واجمعها عن طريق الطرد المركزي. أعد تعليق الحبيبة في 1 ملليلتر من محلول تحلل خلايا الدم الحمراء لكل 3 إلى 4 طحال.

بعد 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة، اغسل الطحال ب PBS وأعد تعليق الحبيبات في 250 ميكرولتر من PBS مع إضافة ألبومين مصل البقري و2 ملم EDTA للعد. بعد ذلك، عزل الخلايا الموجبة ل Ly6 B2 باستخدام الخرزات المناعية المغناطيسية المناسبة وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة وزرع الخلايا الموجبة ل Ly6 B2 بمعدل 1 في 10 إلى 5 خلايا لكل 100 ميكرولتر من الوسط الكامل لكل كثافة البئر في صفيحة سوداء أو بيضاء بسعة 96 بئر. جهز اللقاح البكتيري عند التعددية المطلوبة من العدوى في حجم نهائي 100 ميكرولتر لكل بئر وأضف 100 ميكرولتر من اللقاح أو الوسط البكتيري وحده إلى كل بئر، لعملية حضانة لمدة ساعة في حاضنة زراعة الخلايا.

في نهاية الحضانة، استبدل الوسط ب 200 ميكرولتر من الوسط الطازج الكامل مع 100 ميكروغرام لكل ملليلتر من الجنتاميسين لإزالة أي بكتيريا خارج الخلية المتبقية وإعادة الخلايا إلى حاضنة زراعة الخلايا لمدة ساعتين إضافيتين. في نهاية الحضانة وفي كل نقطة زمنية تجريبية بعدها، استخدم قارئ الألواح لقياس التوهج في كل بئر من صفيحة الزراعة المغطاة قبل إعادة اللوحة إلى حاضنة زراعة الخلايا حتى القراءة التالية.