الكشف الميداني عن البكتيريا في أقسام أنسجة لثة الفئران

خذ مقطعا لثويا من الفأر ملوثا ببكتيريا مرضية، معالج مسبقا للوصول إلى الحمض النووي البكتيري.

ضع عازلا باستخدام مسبار DNA موسوم بالديجوكسيجينين يستهدف الحمض النووي البكتيري.

ضع غطاء وختم لمنع جفاف العينة.

إدخال الحرارة لتغيير طبيعة الحمض النووي، ثم حضانه في ظروف حارة ورطبة للسماح بتهجين المجسات.

قم بتبريد السلايد وإزالة غطاء الغطاء (غطاء)، واغسله عدة مرات باستخدام المخزن لإزالة المجسات غير المربوطة.

أضف محلول حاجب لمنع ارتباط الأجسام المضادة غير المحددة.

حضن الأجسام المضادة المترابطة بالإنزيمات التي ترتبط بالديجوكسيجينين.

اغسل لإزالة الأجسام المضادة غير المربوطة.

أضف مثبطا لتعطيل الإنزيم الداخلي بشكل انتقائي.

ضع ركيزة تتفاعل مع الإنزيم لإعطاء ترسيب ملون.

اشطف بالماء لإزالة الركيزة الزائدة.

أضف صبغة لتلوين النوى.

اغسل لإزالة الصبغة الزائدة.

جفف بالإيثانول وعالجها بالزيلين لزيادة شفافية الأنسجة.

اركب القسم.

تحت المجهر، اتصور البكتيريا داخل القسم.

ابدأ التصوير في الموقع بغمر الشرائح أولا في 2x SSC لمدة 20 دقيقة. وفي الوقت نفسه، قم بتخفيف المجس الموسوم إلى 1 نانوغرام لكل ميكرولتر في مخزن التهجين. بالنسبة للتحكم السلبي، استخدم تركيز 10 أضعاف المجس غير المعنون. ثم قم بتغيير طبيعة المجسات بتسخينه على 90 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، ثم تبريده بسرعة على الثلج.

بعد ذلك، طبق نفس حجم تخفيف المجس على كل شريحة مثل بروتيناز K. ثم غطي أقسام الانزلاق بحذر وأغلقي بطلاء الأظافر. الآن، سخن الشرائح على كتلة جهاز PCR على درجة حرارة 90 درجة مئوية لمدة 10 دقائق وانقلها إلى حاضنة رطبة بدرجة 45 درجة مئوية طوال الليل.

في اليوم التالي، قم بتبريد الشرائح على درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة نصف ساعة، ثم أزل غطاء الغطاء بحذر. الأنسجة هشة. وأخيرا، مرر الشرائح عبر سلسلة من مخازن SSC عند درجة حرارة الغرفة.

اغسل شرائح الهجينة في الموقع لمدة 5 دقائق في MABT. ثم ضع 50 إلى 400 ميكرولتر من محلول الانسداد في 1٪ Tween 20 لمدة 20 دقيقة. بعد الحضانة الكتلية، ضع 50 إلى 400 ميكرولتر من 1 إلى 1000 من الجسم المضاد للفوسفاتاز القلوي المضاد ل-DIG في محلول الانسجام.

دعها تلتصق لمدة 90 دقيقة عند 37 درجة مئوية. بعد تطبيق الشريحة الأساسية، اغسل الشرائح في MABT لمدة 10 دقائق. ثم، لمدة 5 دقائق، ضع الشرائح في مخزن كشف مع 1٪ Tween 20.

الآن ضع 50 إلى 400 ميكرولتر من ليفاميسول بوزن 1 ملي مول في محلول الكشف على كل شريحة، وحضنها لمدة 5 دقائق لتعطيل الفوسفاتاز القلوي الداخلي. بعد ذلك، أضف 50 إلى 400 ميكرولتر من NBT/BCIP مخفف في مخزن كشف بمعدل 1 إلى 100 لكل شريحة، ودع الشرائح تحتضن لمدة ساعتين إلى ثلاث ساعات في غرفة رطبة، بناء على التجربة.

اشطف الزلاجات بماء DI. ثم ضع الميثيل الأخضر بوزن 0.05٪ من حيث الحجم ودع الصبغة المضادة تعمل على النسيج لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. اغسل الشرائح بماء DI مرة أخرى، ثم جففها بإيثانول 100٪، ثم غمس في الزيلين. وأخيرا، ضع 80 ميكرولتر من وسائط التثبيت وغطى شرائح التركيب.