تحضير زراعة البكتيريا الزراعية لنقل الجينات إلى خلايا النبات

ابدأ بزراعة Agrobacterium tumefaciens المزروعة في وسط مع مضادين حيويين لمنع التلوث وضمان احتفاظ البلازميدات.

تحتوي البكتيريا على ناقل تعبير نباتي يحمل جينا ذا اهتمام وجين مقاوم للمضادات الحيوية.

كما تحتوي على بلازميد مساعد يحتوي على منطقة من جينات الضراوة اللازمة لنقل الجين المعني إلى خلايا النبات.

انقل جزءا منها إلى أنبوب يحتوي على وسط مخزن مدعوم بالأسيتوسرينجون، وهو جزيء إشارة مشتق من النبات، والمضادات الحيوية. حضن مع الرج.

ينتشر الأسيتوسيرينجون داخل الخلية، ويحفز مسار إشارات، وينشط التعبير عن جينات الضراوة اللازمة لنقل الجين المعني.

انقل الثقافة، والطرد المركزي لجمع البكتيريا، وتخلص من الفائق.

أضف محلول ملحي واغسل الخلايا مرارا لإزالة المضادات الحيوية المضادة.

أعد تعليق البكتيريا في المخزن باستخدام الأسيتوسيرينجون وحضن البكتيريا دون هز للحفاظ على تعبير جينات الضراوة.

استخدم الثقافة فورا لتحقيق تحول فعال.

استخدم طرفا لاختيار مستعمرة إيجابية من صفيحة LB وتلقيح الخلايا في أنبوب زجاجي يحتوي على 5 ملليلتر من وسط LB مع 50 ميكروغرام لكل ملليلتر من الكاناميسين و50 ميكروغرام لكل ملليلتر من ريفامبيسين. نما الخلايا عند درجة حرارة 30 درجة مئوية مع هز 200 دورة في الدقيقة لمدة 24 إلى 48 ساعة.

انقل 100 ميكرولتر من الزراعة إلى 5 ملليلتر من وسط LB مع نفس المضادات الحيوية، و10 ملليمول MES عند pH 5.6، و20 م