التصوير الزمني لفصل الكروموسومات في البكتيريا الموسومة بالفلورية

ابدأ بورقة أغروز غنية بالمغذيات على إطار معدني يحتوي على بكتيريا تعبر عن أصول كروموسومات فلورية وميكروكرات فلورية.

تدعم وسادة الأغاروز التصاق البكتيريا وحركتها، وتستخدم الكرات الفلورية كمرجع لفصل الكروموسومات المتتبعة.

أضف زيت الغمر إلى العدسة الموضوعية في غرفة الحضانة المسخنة مسبقا في مجهر واسع المجال المقلوب.

ضع العينة فوق العدسة، ثم ركز على منطقة تحتوي على عدة بكتيريا وميكروسفير فلوري واحد على الأقل.

ابدأ تصوير التايم لابس والتقاط صور التباين الطوري والفلورة معا.

يظهر أصل التكرار الموسوم بالفلورية كعنقود مضيء بالقرب من أحد طرفي الخلية.

أثناء التقسيم، يتضاعف الأصل؛ يبقى أحد العنقودها في الطرف الأصلي بينما ينتقل الآخر إلى نهاية الخلية الجديدة.

يتيح هذا الإعداد تتبع فصل الكروموسومات عبر عدة تقسيمات ويمكن تكييفه لتصوير عمليات ديناميكية مماثلة في بكتيريا أخرى، بما في ذلك الأنواع الممرضة أثناء تفاعلات المضيف.

لإجراء المجهر الزمني الصحيح، شغل المجهر وتشغيل برنامج التحكم في المجهر. اختر الهدف الصحيح والمرايا والمرشح الصحيحين لالتقاط صور تباين الطور بالإضافة إلى صور لبروتينات فلورية خضراء، فلورية حمراء، أو فلورية صفراء. أضف قطرة من زيت الغمر عالي الجودة على عدسة الهدف وفي قاع العينة التي تم حضنها مسبقا عند درجة حرارة 32 درجة مئوية.

مع جانب الفتحة باتجاه الهدف، ضع الإطار المعدني مع العينة على مرحلة المجهر، ثم ثبت العينة بإحكام في حامل المسرح. ركز على الخلايا عن طريق تحريك المرحلة في اتجاه Z أقرب إلى الهدف. عندما يلتقي الزيت على الهدف والعينة، حرك المرحلة في اتجاه X/Y.

انتقل إلى برنامج Metamorph وافتح أداة Acquire. اختر تباين الطور في قائمة الإعدادات المنسدلة واضبط زمن التعريض إلى 100 مللي ثانية. انقر على عرض مباشر، ثم أدخل الخلية إلى المستوى البؤري، ثم حرك المرحلة في اتجاه X/Y حتى تظهر عدة خلايا منفردة في مجال الرؤية.

تأكد من وجود ميكروسفير فلوري واحد على الأقل في منطقة الرؤية لمحاذاة الصور المكتسبة لاحقا. بعد ذلك، افتح معالج الاستحواذ متعدد الأبعاد لبرنامج التحكم في المجهر لإعداد تجربة تايم لابس تسمح للمجهر بالتقاط صور على أطوال موجية ومواقع مراحل متعددة إذا لزم الأمر.

في التبويب الرئيسي، قم بتفعيل التايم لابس والأطوال الموجية المتعددة. ستظهر علامات تبويب إضافية على الجانب الأيسر من النافذة. انقر على تبويب الحفظ واختر الدليل لاختيار مجلد فارغ على القرص الصلب لحفظ الصور المكتسبة، ثم فعل زيادة اسم الأساس إذا كان الملف موجودا للتأكد من أن مجموعات البيانات المتتالية لا تكتب فوق المجموعات السابقة. أعط التجربة اسما مع التاريخ واسم السلالة أو عنوان التجربة.

انقر على تبويب التايم لابس لضبط معلمات التايم لابس، ثم اضبط الفترة الزمنية على 20 دقيقة واضبط المدة على 24 ساعة. عدد نقاط التوقيت سيتغير تلقائيا. الآن، اضغط على تبويب الأطوال الموجاتية.

اختر عدد الأطوال الموجية التي يجب الحصول عليها لكل صورة في كل نقطة زمنية عن طريق تغيير الرقم. اختر السماح بحفظ موضع تركيز فوضوي منفصل من الأجهزة لكل طول موجي. انقر على علامة تبويب الطول الموجي الأولى من الأعلى.

في قائمة الإضاءة، اختر تباين الطور. اختر 100 مللي ثانية للتعرض، وفي قائمة الاقتناء، اختر كل نقطة زمنية. قم بإلغاء تفعيل التعريض التلقائي في القائمة المنسدلة باختيار أبدا، واختر كل اكتساب في القائمة المنسدلة للتركيز التلقائي.

اضبط التعريض لكل طول موجي كما هو موضح باستخدام المعلمات التالية. ثم، لالتقاط صور من عدة مواقع على المرحلة، في التبويب الرئيسي، قم بتفعيل مواقع المراحل المتعددة. انقر على تبويب المسرح ثم زر البث المباشر للنظر إلى مجال الرؤية.

حرك المرحلة في اتجاه X/Y حتى يصبح عائد الاستثمار في مجال الرؤية. احفظ إحداثيات X و Y في تبويب المرحلة بالنقر على علامة الجمع. حرك المرحلة مرة أخرى في اتجاه X/Y حتى يتم العثور على عائد جديد وحفظ الإحداثيات مرة أخرى بالنقر على علامة الجمع.

استمر حتى يتم حفظ عدد المناطق المطلوب. تحقق مرة أخرى من أن الخلايا في بؤرة التركيز بالنقر على المواقع المحفوظة X وY المختلفة، وابدأ التركيز التلقائي على الأجهزة بالضغط على الضغط على AFC مع الاستمرار للحفاظ على ثبات موضع Z المحفوظ طوال التجربة. ابدأ تسجيل التايم لابس في معالج الاكتساب متعدد الأبعاد في برنامج التحكم بالمجهر بالنقر على اكتساب.

تحقق من أن الخلايا لا تزال في بؤرة التركيز بعد النقاط الزمنية الأولى في تسجيلات التايم لابس لتعظيم جودة الصور وإعادة التركيز إذا لزم الأمر.