موسوعة JoVE للتجارب
علم الأحياء الدقيقة
0 مشاهدة • 3:48 دقيقة • February 26th, 2026
ابدأ بسمكة زرد بالغة مصابة بسلالة مقاومة للمضادات الحيوية من فيبريو كوليرا. تعبر هذه البكتيريا الممرضة عن إنزيم β-جالاكتوسيداز وتستعمر الجهاز الهضمي.
اجمع السمك وانقله إلى محلول يحتوي على جرعة زائدة من المخدر لقتله.
ضع الجانب السفلي للأعلى من السمك وثبته بدبابيس.
عقم البطن، وقم بعمل شق جلدي طولي وجرين جانبيين باتجاه الرأس، ثم ثبت الجلد لكشف الجهاز الهضمي.
انقل المسار إلى أنبوب تجانس يحتوي على عازل بارد مع خرز زجاجي.
يحتضن البكتيريا مع التحريك، مما يسمح للخرز الزجاجي بتعطيل الأنسجة وإطلاق البكتيريا.
قم بتخفيف التجانس بشكل تسلسلي، ثم وضعه على الوسط، ثم حضن. يحتوي الوسط على ركيزة كروموجينية من β-جالاكتوسيداز ومضاد حيوي للقضاء على الملوثات.
تعبر البكتيريا عن إنزيم β-جالاكتوسيداز، الذي يقوم بتحلل الركيزة الكروموجينية مما يؤدي إلى تكوين مستعمرات ذات صبغة زرقاء.
عد المستعمرات لتقدير الحمل البكتيري المعوي.
عندما تصل التجربة إلى النقطة المطلوبة، خذ عينة بحجم 15 ملليلتر من ماء العدوى لأغراض التشخيص. ثم اجمع الأسماك وتخلص من الماء الملوث بشكل مناسب. وجه الجانب البطني للأعلى وثبت الجسم بدبوس عبر الفك السفلي ودبوس آخر خلف فتحة الشرج.
وجه كلا الدبوسين بعيدا عن الجسم. بعد ذلك، امسح السطح السفلي للسمكة بنسبة 70٪ إيثانول. ثم تعقيم المشرط ومقص فاناس باستخدام 70٪ إيثانول ولهب.
الآن، باستخدام المشرط، قم بعمل شق صغير بطول في البطن يخترق القشور، لكنه يقطع فقط بعمق الجلد. بعد ذلك، باستخدام المقص، قم بتمديد الشق بحذر على طول الجسم، بحيث لا يقطع أعمق من مستوى الجلد. تجنب قطع فتحة الشرج.
ثم قم بعمل قطعتين جانبيتين نحو الرأس لتوسيع الفتحة. ثم ثبت الجلد على جانبي الشقوق الجانبية على سطح التشريح، مع توجيه الدبابيس بعيدا عن الجسم. يجب أن يكون الجهاز الهضمي مرئيا الآن كأنبوب رفيع جدا وشاحب.
الآن، استخدم زوجين من الملقط المعقم باللهب لإزالة الجهاز الهشة بالكامل بعناية. انقل النسيج إلى أنبوب تجانس يحتوي على خرزات زجاجية وملليلتر واحد من محلول البرودة. بعد ذلك، قم بتجانس الأنسجة كما هو موضح في البروتوكول النصي وقياس مستويات الاستعمار المعوي.
بعد ذلك، قم بتخفيفات متسلسلة للمتجانس والأمعاء والعازل. لكل سمكة، حضر خمسة أو ستة تخفيفات بحجم عشرة أطعاف في حجم ملليلتر واحد. قم بعمل دوامة للأنابيب للخلط.
ثم ضع لوح من 100 إلى 200 ميكرولتر من كل تخفيف على ألواح LB أجار تحتوي على ستريبتوميسين وX-gal. حضن الألواح على حرارة 30 درجة مئوية لمدة 16 إلى 18 ساعة. بعد الحضانة الليلية، عد مستعمرات V. cholerae على اللوحات.
عادة ما تنتج هذه البكتيريا مستعمرات زرقاء باهتة على وسط LB مع X-gal.