التقييم المجهري لتثبيط تكوين الأغشية الحيوية بواسطة الإنزيمات

ابدأ بطبقين صغيرين بقاع زجاجي يحتويان على معلقات لبكتيريا تشكل الأغشية الحيوية.

يحتوي طبق العلاج على إنزيم نشط يعطل الإشارات، بينما يشمل الضابط الإنزيم المعطل.

غط الصحون وحضن البكتيريا للسماح بالالتصاق البكتيريا بسطح الميكروالصحن.

اغسل لإزالة الخلايا غير الالتصقة، ثم أدخل وسط طازج يحتوي على الإنزيمات وحضنها.

في طبق التحكم، تتواصل البكتيريا عبر جزيئات الإشارة وتنتج مواد بوليمية خارج الخلية (EPS)، مكونة طبقة حيوية.

يقوم الإنزيم النشط بتحليل جزيئات الإشارة، مما يعطل وظيفتها ويقلل من تكوين الأغشية الحيوية.

قم بتجديد الحوض بوسط جديد واحتضن المزيد لتعزيز تأثيرات الإنزيم في تعطيل الأغشية الحيوية.

أزل الوسط، أضف الليكتين الموسوم بالفلورية، وحضن للسماح لليكتين بالارتباط ب EPS.

اغسل لإزالة أي ليكتين غير مربوط.

حضن الطبق بمادة تثبيت للحفاظ على بنية الفيلم الحيوي، ثم شطف الطبق.

الحصول على صور المجهر الكونفوكالي لتقييم الكبت الذي ينظمه الإنزيم لتكون الأغشاء الحيوية.

لإجراء المجهر الماسح بالليزر الكونفوكي، أو CLSM، لأغشية A. baumannii S1 الحيوية، قم بزراعة مزرعة بحجم 5 ملليتر من A. baumannii S1 في الكتلة الدقيقة عند 30 درجة مئوية في حاضنة اهتزاز لمدة 16 ساعة. قم بضبط زراعة A. baumannii S1 إلى OD₆₀₀ بقيمة 0.8.

ثم استخدم LB طازج يحتوي على 1.2 ملليغرام لكل ملليتر من إنزيم GKL المنقى لتخفيف الزرعة، من 1 إلى 100، وأضف 1 ملليتر إلى ميكرو طبق زجاجي بسعة 35 ملليتر. غط الطبق بغطاء وضعه في حاوية بلاستيكية سعة 10 لترات وأغلقه قبل حضان الطبق على 30 درجة مئوية لمدة ثلاث ساعات. بعد إزالة الوسط بلطف، أضف 1 ملليلتر من الوسط الطازج الذي يحتوي على 30 ميكرولتر من إنزيم GKL المنقي، ثم حضن على حرارة 30 درجة مئوية لمدة 21 ساعة أخرى.

أزل الوسط بلطف مرة ثانية واستبدل بملليتر آخر من إنزيم GKL في وسط جديد. حضن عند 30 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. بعد الحضانة، أزل الوسط بلطف وأضف 500 ميكرولتر من 5 ميكروغرام لكل ملليلتر من أليكسا فلور 488 متجبر جرثوم القمح المذاوب في HBSS.

حضن الطبق الصغير عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لتلوين الأغشية الحيوية. لتثبيت الأغشية الحيوية، أضف 500 ميكرولتر من الفورمالديهايد بنسبة 3.7٪ مذاب في HBSS وحضن عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. استخدم 2 ملليلتر من HBSS لغسل الميكرو دينية مرة واحدة، ثم أزل المحلول تماما.

احتفظ بالطبق في الظلام عند 4 درجات مئوية قبل تصوير CLSM. لتصوير وتحليل CLSM، استخدم هدفا 63 X لتوليد 97 مكدسا لكل صورة بفاصل 0.21 ميكرون لكل مجموعة.