صبغ المناعة للآفات الدقيقة المملوءة بالبكتيريا في قسم أنسجة القلب في الفأر للتصوير

ابدأ بشريحة تحتوي على قسم نسيج قلبي مثبت كيميائيا من فأر مصاب بالمكورات الرئوية، وهي بكتيريا ممرضة.

تتسبب هذه العدوى في تكوين آفات دقيقة خارج الخلية مليئة بالبكتيريا داخل عضلات القلب.

اغسل القسم بمحلول مؤقت لإزالة أي مثبت متبق.

ضع منظفا غير أيوني لنفير أغشية الخلايا المضيفة.

اغسله مرة أخرى لإزالة أي مسحوق تنظيف متبق.

حضن المقطع بعامل حاجب لحجب مواقع الارتباط غير المحددة.

اشطف لإزالة عامل الانسداد غير المرتبط.

إدخال جسم مضاد أولي يرتبط بعديد السكريات الكبسولوري للبكتيريا.

اغسل لإزالة أي جسم مضاد غير مرتبط، ثم أضف جسما مضادا ثانويا أخضر موسوما بالفلوروفور ويرتبط بالجسم المضاد الأساسي.

صبغ مضاد بصبغة نووية لتسمية نوى الخلايا المضيفة.

اغسل القسم وركبه باستخدام وسط تركيب.

راقب المقطع باستخدام المجهر الكونفوكلي لرؤية البكتيريا الموسومة داخل الآفات الدقيقة.

باستخدام مقطع قلبي بحجم 5 ميكرون على شرائح زجاجية موجبة الشحنة، قم أولا بتجميد الأجزاء، ثم إذابتها ودعها تجف في الهواء. ثبت الشرائح في الفورمالين المحايد 10٪ لمدة 10 دقائق عند 25 درجة مئوية. ثم أزل المثبت بثلاث غسلات وPBS لمدة خمس دقائق في كل غسلة.

تابع ذلك بنفاذ الأنسجة بنسبة 0.2٪ ترايتون X-100 في PBS لمدة 15 دقيقة. أزل المغسل بثلاث غسلات أخرى باستخدام PBS مباشرة. ثم قم بإغلاق الأنسجة بسيروم الماعز بنسبة 10٪ في PBS لمدة ساعة. بعد الشطف ب PBS، غط القسم بالمصل لمدة ساعتين عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. عالج الضوابط السلبية بمضاد الأرنب الساذج.

نظرا لأن نسيج القلب يمتص بسهولة صبغة الفلورية المناعية XI بسهولة، مما يؤدي إلى مستويات خلفية عالية، فمن المرجح أن يكون من الضروري تحسين تركيز أنواع الأجسام المضادة المختلفة في وقت الحضانة.

بعد ساعتين، اغسل مضاد المصل ب PBS. ثم استبدل المحلول بجسم مضاد ثانوي ودع الشرائح تحتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة أخرى. الآن، ضع DAPI بمقدار 5 ملليغرام لكل ملليلتر واغسل الشرائح ب PBS. وأخيرا، قم بتركيب الشرائح في FluorSave وصورها باستخدام المجهر الكونفوكلي.