اختبار مقاومة الإيثانول لتقييم سلامة مصفوفة الأغشية الحيوية

خذ أغشية حيوية مشتقة من البكتيريا الممرضة تنمو على الأجار المغذية.

يتميز الغشاء الحيوي غير المعالج ببكتيريا مكتظة بكثافة داخل مصفوفة حماية خارج الخلية.

يتميز الغشاء الحيوي المعالج بالمثبطات بخلايا مرتبطة بشكل فضفاض ضمن مصفوفة متفرقة.

اقسم كل طبقة حيوية إلى نصفين، ثم تعرض نصف واحد للعزل كعنصر تحكم، والآخر للإيثانول لفرض إجهاد مضاد للميكروبات.

في الغشاء الحيوي غير المعالج والمعرض للإيثانول، تقلل المصفوفة الكثيفة من انتشار الإيثانول وتحد من اختراق الخلايا، مما يقلل من قتل البكتيريا.

في الغشية الحيوية المعالجة بالمثبطات والمعرضة للإيثانول، تسمح المصفوفة المتناثرة للإيثانول بالاختراق بسهولة أكبر، مما يؤدي إلى زيادة قتل البكتيريا.

قم بعمل الطرد المركزي للأنابيب وإزالة السوبرناتانت. أضف العزل والصوت لتشتيت الخلايا.

قم بتغليف المعلقات المخففة واحتضنها للسماح بنمو البكتيريا القابلة للحياة.

وحدات تشكيل المستعمرات (CFUs)؛ تؤكد وجود عدد أقل من الفروع الكيميائية من الغشاء الحيوي المعالج بالمثبطات والمعرض للإيثانول أن سلامة المصفوفة ضرورية لمقاومة الإيثانول.

خذ شفرة حلاقة نظيفة وقطع مستعمرات الغشاء الحيوي إلى جزأين متساويين بمساعدة القالب. ارفع نصف المستعمرة بعناية باستخدام ملعقة نظيفة، وانقله إلى أنبوب طرد مركزي دقيق بسعة 1.5 ملليلتر، يحتوي على 500 ميكرولتر من PBS.

خذ النصف الثاني من المستعمرة وانقله إلى أنبوب طرد مركزي دقيق يحتوي على 500 ميكرولتر من 50٪ إيثانول. ستستخدم هذه العينات لتقييم مقاومة عوامل التعقيم. بعد ذلك، خذ النصف الأول من مستعمرة D-leucine المعالجة وضعها في PBS.

ثم، خذ النصف الثاني من هذه المستعمرة وانقله إلى الإيثانول. حضن جميع الأنابيب التي تحتوي على نصف الغشاء الحيوي لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. ثم قم بطرد مركزها لمدة خمس دقائق عند 18,000 مضروبة في جرام.

باستخدام ماصة، أزل السوبرناتانت بحذر. أضف 300 ميكرولتر من PBS، ثم قم بسوتيكات الخلايا على مستوى منخفض باستخدام جهاز ميكروتيب. أضف 700 ميكرولتر إضافي من PBS ليصبح حجم نهائي يبلغ ملليتر واحد.

بعد ذلك، قم بتخفيف تسلسلي من 10 إلى سالب سبعة في PBS. خذ 100 ميكرولتر من أحد التخفيفات، وقم بتلقيح صفيحة أجار LB بنسبة 1.5٪. كرر هذه الخطوة لتخفيفين آخرين لكل عينة.

فرد اللقاح باستخدام خرز زجاجي، ثم حضن الألواح طوال الليل عند درجة حرارة 30 درجة مئوية. افحص الألواح وعد وحدات تشكيل المستعمرة، أو CFU. بعد حساب قيمة CFU لكل مليلتر، احسب نسبة الناجين في PBS مقابل معالجات الإيثانول.