تلقيح ممرض بكتيريا في أوراق الأرابيدوبسيس عبر تسرب الفراغ

خذ مزرعة بكتيرية قادرة على إصابة أنسجة الأوراق.

قم بكشط المستعمرات وعلق في محلول ملحي.

قس الكثافة البصرية لتقييم تركيز البكتيريا، ثم تخفيفه إلى الكمية المطلوبة من الكثافة الزائدة.

قم بتخفيفات متسلسلة للوصول إلى التركيز النهائي لللقاح.

أضف مادة فعالة لتقليل التوتر السطحي وضمان انتشار البكتيريا بشكل متساو على الورقة.

انقل التعليق إلى طبق بتري.

بعد ذلك، ضع عصوين خشبيين على قمة وعاء الأرابيدوبسيس .

اقلب النبات فوق الطبق، واغمس الأوراق في التعليق.

ضع الإعداد في غرفة تفريغ وطبق نبضة تفريغ

يقوم الفراغ المطبق بإزالة الهواء من نسيج الورقة عبر فتحات طبيعية.

إطلاق الفراغ يعيد الضغط الجوي، مما يجبر البكتيريا على الدخول إلى الأوراق.

كرر النبضات لتحقيق أقصى تسرب ممكن.

أزل الوعاء. ثم قم بمسح اللقاح الزائد.

أوراق الأرابيدوبسيس المصابة بالبكتيريا جاهزة للتحليل في المرحلة اللاحقة.

انقل مخزون الجلسرون من سلالة Pseudomonas syringae محل الاهتمام من ناقص 80 درجة مئوية إلى طبق LB مغطى بالمضادات الحيوية المناسبة. حضن الطبق عند 28 درجة مئوية لمدة 40 إلى 48 ساعة. اكشط الكتلة الحيوية البكتيرية وأعد تعليقها في خمسة ملليلتر من كلوريد المغنيسيوم بوزن 10 ملليمولات.

قس الكثافة البصرية عند 600 نانومتر وضبطها إلى 0.1 بإضافة كلوريد المغنيسيوم بقيمة 10 ملليمولات. قم بتخفيفات متسلسلة في كلوريد المغنيسيوم بحجم 10 ملليمولات للحصول على تركيز نهائي في اللقاح 5 مرات 10 إلى الخامس CFU لكل ملليلتر. ثم جهز 200 ملليلتر من اللقاح لنباتات الأرابيدوبسيس و50 ملليلتر لنباتات الفاصوليا.

قبل التطعيم، أضف مادة الخافضة للتوتر السطحي سيلويت L-77 إلى تركيز نهائي 0.02٪ لتطعيم الفاصوليا و0.01٪ للأرابيدوبسيس. لتسرب الأرابيدوبسيس ، ضع عصوين خشبيين يشكلان حرف X فوق الوعاء وضع الوعاء مواجها للأسفل فوق طبق بتري قطره 14 سنتيمترا يحتوي على 200 ملليلتر من اللقاح. لتلقيح أوراق الفاصوليا، أدخل النباتات ومحلول التلقيح في غرفة تفريغ وأدخل الورقة في أنبوب طرد مركزي مخروطي بسعة 50 ملليلتر يحتوي على اللقاح.

أعط نبضة 500 مليبار لمدة 30 ثانية لتتسلل إلى الأوراق. قم بتصريف محلول اللقاح الزائد بقطعة ورق، وأعد النباتات إلى غرفة النمو المناسبة.