Reverse Transcriptase Activity as a Marker for Virus-Like Particle Production
JoVE Encyclopedia of Experiments
علم الأحياء الدقيقة
0 مشاهدات • 3:26 د • July 31st, 2026
Begin with wells containing adherent mammalian cells co-transfected with plasmids encoding viral proteins and either a non-inhibitory control RNA or an inhibitory RNA.
In the control wells, viral proteins, including reverse transcriptase (RT), assemble into mature virus-like particles (VLPs) and are released into the supernatant.
In the test wells, the inhibitory RNA suppresses viral protein expression, reducing VLP production.
Transfer the supernatant to a lysis buffer and incubate to lyse the VLPs, releasing RT.
Add a buffer containing radiolabeled nucleotides, primers, a synthetic RNA template, and cofactors, then incubate.
The RT incorporates the labeled nucleotides into new strands.
Spot the mixture onto a charged filter paper, dry it, and wash with a buffer to remove unbound nucleotides.
Perform an alcohol wash to remove residual salts.
Measure radioactivity to quantify RT activity, indicating VLP production.
Reduced VLP production in test samples indicates suppression by the inhibitory RNA.
To carry out the viral production assay, after removing the 24-well cell culture plates from the incubator, transfer them to the BSL-3 cell culture hood. Gently swirl the plates and then transfer 150 microliters of the supernatant from each well to a corresponding well in a 96-well flat-bottom plate to be used to quantify HIV-1 production. Transfer 5 microliters of supernatant to the corresponding wells in a 96-well plate containing 25 microliters of a viral disruption cocktail.
After incubating the mixture for five minutes at room temperature, transfer the plate to a radioactivity work station. Next, prepare a radioactive cocktail, and add 25 microliters to each well of viral supernatant and disruption cocktail. Incubate the plates at 37 degrees Celsius for two hours.
Spot 5 microliters of the reaction mixture onto corresponding squares in a glass fiber DEAE filter mat paper, and allow the spots to dry for 10 minutes. Use 2x SSC buffer to wash the papers five times for five minutes each, followed by two one-minute washes with 95% ethanol. Allow the papers to dry before sealing them in sample bags.
Clip sample bags containing the filter mat paper into a cassette, and insert the cassette into a microplate scintillation counter. Then start the counter. For any viral quantification method, divide the values obtained for each test RNA by the adjacent negative control and multiply this value by 100 to get the percent inhibition of HIV-1 production for each replicate of the test RNAs.
نظرة عامة
تقدم هذه المقالة بروتوكولاً لتقييم فعالية وسمية جزيئات الـ RNA المصممة لتثبيط إنتاج HIV-1، وذلك باستخدام مقايسة النسخ العكسي (RT) كمقياس كمي لمخرجات الجسيمات الشبيهة بالفيروسات (VLP). تتضمن الطريقة إجراء ترنسفكشن مشترك للخلايا الثديية باستخدام بلازميدات وجزيئات الـ RNA المختبرة، يلي ذلك قياس نشاط الـ RT في السائل الطافي لتقييم كبح التعبير الجيني الفيروسي.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- البيولوجيا الجزيئية
- علم الفيروسات
- أبحاث العلاج الجيني
خلفية علمية
- يمكن تثبيط إنتاج HIV-1 بواسطة جزيئات RNA المثبطة التي تستهدف التعبير الجيني الفيروسي.
- يعمل نشاط إنزيم النسخ العكسي كعلامة بديلة لإنتاج VLP.
- تمكن اختبارات RT الكمية من تقييم الفعالية المضادة للفيروسات في المختبر (in vitro).
- يعد القياس الموثوق لمخرجات VLP أمراً ضرورياً لتقييم جزيئات RNA العلاجية المرشحة.
الغرض من الدراسة
- لتقييم قدرة جزيئات RNA المختبرة على تثبيط إنتاج HIV-1 في الخلايا الثديية.
- لتوفير طريقة كمية لقياس ناتج VLP عبر نشاط RT.
- لإنشاء بروتوكول مناسب لفحص العلاجات الجينية أو الدوائية القائمة على RNA والتي تستهدف HIV-1.
الطرق المستخدمة
- الترانسفكشن المشترك للخلايا الثديية الملتصقة ببلازميدات تشفر بروتينات HIV-1 وإما حمض نووي ريبوزي (RNA) مثبط أو ضابط.
- جمع السائل الطافي الذي يحتوي على الجسيمات الشبيهة بالفيروسات (VLPs) المتحررة.
- تحليل الجسيمات الشبيهة بالفيروسات (VLPs) لتحرير إنزيم النسخ العكسي (RT).
- التحضين مع نيوكليوتيدات مُعلمة إشعاعياً وبادئات وقالب RNA تخليقي للسماح بدمج النيوكليوتيدات بوساطة إنزيم النسخ العكسي (RT).
- وضع خلائط التفاعل على ورق ترشيح مشحون، يلي ذلك غسلات متتالية بالمحلول المنظم والإيثانول.
- قياس النشاط الإشعاعي باستخدام عداد الوميض لتقدير نشاط إنزيم النسخ العكسي (RT) كمياً.
- حساب نسبة التثبيط من خلال مقارنة عينات الـ RNA المختبرة بالضوابط السلبية.
النتائج الرئيسية
- تعمل جزيئات الـ RNA المثبطة على تقليل نشاط إنزيم RT في الراشح، مما يشير إلى انخفاض إنتاج جزيئات VLP.
- لا تمنع جزيئات الـ RNA الضابطة نشاط إنزيم RT، مما يؤكد خصوصية المقايسة.
- يتيح هذا البروتوكول إجراء مقارنة كمية بين تركيبات RNA المختلفة من حيث قدرتها على تثبيط إنتاج HIV-1.
- توفر قيم نسبة التثبيط مقياساً معيارياً لتقييم الفعالية.
الاستنتاجات
- يعد مقايسة RT طريقة فعالة وكمية لتقييم تثبيط إنتاج HIV-1 بواسطة جزيئات RNA المرشحة.
- هذا البروتوكول مناسب لفحص العلاجات القائمة على RNA التي تستهدف HIV-1.
- يسهل التحديد الكمي الموثوق لمخرجات VLP تطوير العلاجات الجينية أو الدوائية ضد HIV-1.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
توفر مقايسات النسخ العكسي الكمي (RT) قراءة قوية وقابلة للتوسع لتقييم فعالية التدخلات القائمة على RNA التي تستهدف إنتاج HIV-1. يتيح هذا النهج التحقق من الهدف في المراحل المبكرة وتقليل المخاطر الآلية من خلال ربط التثبيط الجزيئي بالتثبيط الوظيفي لمخرجات الجسيمات الشبيهة بالفيروسات (VLP). وتدعم هذه الطريقة فرز المحفظة وتحديد أولويات العلاجات الجينية أو الدوائية المرشحة في مسارات اكتشاف مضادات الفيروسات.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- يتيح الاستقصاء المباشر للفرضيات العلاجية التي تستهدف التعبير الجيني الفيروسي.
- يوفر التحقق الوظيفي من الحموض النووية الريبوزية المثبطة من خلال القياس الكمي لمخرجات VLP.
- يدعم تقليل المخاطر الميكانيكية عن طريق عزل تأثير الحموض النووية الريبوزية المختبرة على تجميع البروتين الفيروسي.
- يسهل الثقة التنبؤية في اختيار المرشحين لمزيد من التطوير.
الفحص وتطوير المقايسة
- يقدم مقايسة معيارية وقابلة للتكرار للفحص عالي الإنتاجية لبنى RNA.
- يولد بيانات كمية لنشاط RT لمقارنة الفعالية عبر عدة مرشحات.
- يضمن جاهزية المقايسة لتقييم المركبات اللاحق وقابلية توسيع المنصة.
- يدعم القياس المرجعي الموثوق لقوة التثبيط في نظام محكوم.
الأبحاث الانتقالية وما قبل السريرية
- يربط بين تثبيط إنتاج VLP في المختبر واستراتيجيات المؤشرات الحيوية الترجمية.
- يوفر استمرارية من مرحلة الاكتشاف الجزيئي إلى التحقق قبل السريري من آليات مضادات الفيروسات.
- يتيح اتخاذ قرارات تطوير معدلة وفقاً للمخاطر بناءً على مقاييس تثبيط كمية.
- يعزز القيمة التنبؤية للدراسات اللاحقة التي تجرى في الجسم الحي أو الدراسات السريرية.
تكامل مسار العمل وسير العمل
يُدمج هذا المقايسة القائمة على إنزيم النسخ العكسي (RT) ضمن سلسلة العمليات الممتدة من الاكتشاف المبكر إلى تحديد المركبات الرائدة، مما يربط بين التصميم الجزيئي والتحقق قبل السريري للمرشحات المضادة للفيروسات.
- بيولوجيا الاكتشاف: تدعم اختبار الفرضيات وتوضيح المسارات من خلال قياس تأثير الرنا (RNA) المثبط على إنتاج الجسيمات الشبيهة بالفيروسات (VLP).
- الفحص المسحي: توفر قراءات كمية قابلة للتكرار لتحديد أولويات المرشحين وتوحيد معايير المقايسة.
- التحليلات: تقدم مقاييس النسبة المئوية للتثبيط للمقارنة بين الظروف المختلفة والتحليل الإحصائي.
- الأبحاث الانتقالية: تسهل المواءمة مع نقاط النهاية الخاصة بالكبح ذات الصلة بالمرض من أجل التقدم في الدراسات قبل السريرية.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: توفر منصة قابلة للتطوير وإعادة الاستخدام لتقييم استراتيجيات متنوعة مضادة للفيروسات تعتمد على الرنا (RNA).
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تزيد من الثقة التنبؤية وتقلل من الغموض الميكانيكي في التحقق من الهدف.
- القيمة التشغيلية: تعزز التقييس وقابلية التكرار وقابلية التوسع في سير عمل فحص مضادات الفيروسات.
- القيمة الاستراتيجية: تحسن عملية اتخاذ قرارات المتابعة أو التوقف (go/no-go) وكفاءة رأس المال من خلال توفير بيانات كمية عن الفعالية.
- تأثير المحفظة: تتيح تحديد الأولويات المعدلة حسب المخاطر والدفع بمرشحات مضادات الفيروسات عالية الثقة نحو مراحل متقدمة.
اعتبارات التنفيذ
- تتطلب خبرة في علم الفيروسات الجزيئي وتنفيذ المقايسات الكمية.
- تستلزم الوصول إلى بنية تحتية للتعامل مع الوسوم الإشعاعية وأجهزة عد الوميض.
- تتطلب توحيداً معيارياً بين الفرق لإعداد المقايسات وبروتوكولات تحليل البيانات.
- قد تتطلب تكيفاً مع أنظمة فيروسية مختلفة أو أنماط متنوعة من الـ RNA.
- تتضمن احتياطات المستوى الثالث من السلامة البيولوجية (BSL-3) للتعامل مع المكونات الفيروسية.
الأسئلة الشائعة حول الأدوية الحيوية
![الفرز على نطاق الجينوم [رني] تحديد العوامل المضيفة التي تعدل علاج فيروس أونكوليتيك](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F56913.jpg%3Fv%3D2026-08-11T08%253A27%253A19.518Z&w=384&q=75)
الفرز على نطاق الجينوم [رني] تحديد العوامل المضيفة التي تعدل علاج فيروس أونكوليتيك
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
3 '-تيرميني وتسلسل الجزيئات الوليدة الدنا الفيروسي واحد-الذين تقطعت بهم السبل أثناء فيروس نقص المناعة البشرية-1 تحديد عكس النسخ في الخلايا المصابة
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
الكشف عن فيروس نقص المناعة البشرية النوع 1 (HIV-1) البروتين انتيسنس (ASP) الحمض الريبي النيبالي المستنسخات في المرضي التي كتبها RT-PCR الخاصة
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
تضخيم وقياس HIV - 1 الحمض النووي الريبي في الأفراد المصابين بالايدز مع الأحمال الفيروسية أقل من الحد كشفها بواسطة فحوصات السريرية القياسية
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
علم الوراثة العكسية الاسترداد بوساطة من نوروفيروس الفئران المعدية
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
اللقاحية مراسل الفيروسات لقياس وظيفة الفيروسية في جميع مراحل التعبير الجيني
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
تقييم فعالية وسمية الرنا استهداف HIV-1 الإنتاج للاستخدام في الجينات أو العلاج بالعقاقير
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
كشف شبه كمي النشاط المعتمدة على الحمض النووي الريبي بوليميراز الحمض النووي الريبي للبروتين البشري Telomerase المنتسخة العكسية
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
قياس فيروس حمى الدنج الجيش الملكي النيبالي في المادة طافية الثقافة من الخلايا المصابة بسلسلة البلمرة الكمية في الوقت الحقيقي
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
إنتاج جسيمات بسيودوتيبيد لدراسة كورونافيروس شديد العدوى في إعداد 2 مستوى السلامة الأحيائية
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
آخر تحديث: 22 أغسطس 2026