إنتاج الفيروسات الكاذبة باستخدام ترانسفكشن البلازميد في الخلايا البشرية

ابدأ باستخدام دورق استنبات يحتوي على خلايا كلية جنينية بشرية في وسط غني بالمغذيات.

استبدل الوسط بوسط جديد يحتوي على الكلوروكين لتعزيز إيصال البلازميد إلى الخلايا.

خذ خليطاً من البلازميدات التي تشفر بروتينات سطح الإنفلونزا، وبروتينات النواة للفيروس اللينتي، والجينوم الفيروسي اللينتي، جنباً إلى جنب مع فوسفات الكالسيوم. يتم التحضين لتكوين معقدات فوسفات الكالسيوم–DNA.

أضف الخليط إلى الخلايا وامزجه بلطف. قم بالتحضين للسماح للمركب بالدخول إلى الخلايا عن طريق الالتقام الخلوي (endocytosis). ويعزز الكلوروكين الهروب الإندوسومي للحمض النووي البلازميدي (plasmid DNA).

داخل الخلية، يقوم الحمض النووي البلازميدي (plasmid DNA) بتحفيز التعبير عن كل من مكونات فيروس الإنفلونزا والفيروس البطيء (lentiviral).

استبدل الوسط لإزالة المعقدات الزائدة.

يتم التحضين للسماح للمكونات الفيروسية بالتجمع والتبرعم على شكل فيروسات كاذبة، والتي تتحرر في وسط الزرع.

قم بجمع الوسط الذي يحتوي على الفيروسات الكاذبة، ثم قم بالطرد المركزي لترسيب الحطام الخلوي.

اجمع السائل الطافي المحتوي على الفيروسات الكاذبة واحفظه في درجات حرارة منخفضة من أجل المقايسات اللاحقة.

للبدء، قم بتحضير معلق خلوي أحادي من خلايا HEK 293FT في وسط DMEM كامل. أضف 10 mL من المعلق الخلوي الأحادي إلى قارورة T75، ثم اتبع ذلك بالتحضين عند 37 °C.

قبل ساعتين من عملية عفن الخلية (transfection)، استبدل الوسط القديم بعشرة ملليلترات من الوسط الكامل الطازج الذي يحتوي على الكلوروكين. اخلط الكواشف والحمض النووي البلازميدي (plasmid DNA) كما هو موضح في المخطوطة. ثم انقل هذا الخليط إلى الوسط فوق الخلايا وقم بهز الدورق برفق.

بعد الحضن، استبدل الوسط بـ 15 mL من وسط DMEM الكامل الطازج. وبعد مرور 65 ساعة، اجمع المادة الطافية عن طريق الطرد المركزي. ثم اجمع المادة الطافية وقم بتقسيمها إلى حصص.