موسوعة JoVE للتجارب
علم الأحياء الدقيقة
0 مشاهدة • 2:54 دقيقة • August 31st, 2026
خذ عيناً مستأصلة من نموذج فأر يعاني من تعطل الحاجز الشبكي، ومحقونة مسبقاً بفيروس مرتبط بالأدنو (adeno-associated virus) يحمل جين البروتين الفلوري الأخضر.
يسمح اختلال الحاجز الشبكي للفيروس المرتبط بالغدّة (AAV) باختراق الخلايا المستقبلة للضوء، حيث يتم التعبير عن الجينوم الفيروسي لإنتاج البروتين الفلوري الأخضر (GFP)، مما يجعل الخلايا فلورية.
قم بتشريح العين لإزالة القرنية والعدسة، مع ترك كأس العين سليمًا.
اغمر كأس العين في محلول مثبت للحفاظ على بنية الشبكية.
انقل كأس العين بالتتابع عبر تركيزات متزايدة من محاليل الحماية من التجميد. لاحقاً، يتم التحضين في التركيز النهائي لمنع تكون بلورات الجليد.
قم بتضمين كأس العين في وسط تجميد (cryo-medium) ثم جمدها.
استخدم جهاز الميكروتوم المجمد (cryostat) لتقطيع كأس العين إلى شرائح رقيقة.
ثبّت المقطع على شريحة. أضف محلولاً منظماً يحتوي على منظفات لنفاذية الأنسجة، وذلك للسماح للأجسام المضادة بالوصول إليها أثناء عملية التصبيغ المناعي اللاحقة.
اشطف المقطع. ثم عامله بمحلول حجب لمنع التفاعلات غير النوعية للأجسام المضادة أثناء الصبغ المناعي.
أصبحت المقاطع التجميدية للشبكية جاهزة لإجراءات الصبغ المناعي الإضافية والتصوير الفلوري. وتكشف الخلايا الفلورية الموجبة لـ GFP عن نجاح التنحي الفيروسي، مما يشير إلى نفاذية الشبكية.
بعد استئصال العينين من حيوان محقون تم القضاء عليه رحيمًا، قم بتشريح العينين لإزالة العدسة والقرنية. بعد ذلك، قم بتثبيت العين المشرحة عن طريق الغمر في 4% paraformaldehyde لمدة ساعة واحدة. وبعد مرور ساعة، قم بحماية العينين من التجمد في 10% sucrose لمدة ساعة أخرى في درجة حرارة الغرفة. ثم انقع العينين في 20% sucrose لمدة ثلث ساعة في درجة حرارة الغرفة.
أخيراً، تُترك العيون في محلول سكروز 30% طوال الليل عند درجة حرارة 4 °C. وفي اليوم التالي، تُجمد وتُطمر أكواب العين في راتنج تطمير مثل Cryo-matrix. بعد ذلك، وباستخدام الميكروتوم المجمد (cryostat)، يتم عمل قطاعات بسمك 10 µm وتثبيتها على شرائح مجهزة للأنسجة المجمدة.
الآن، قم بنفاذية المقاطع الموجودة على الشرائح باستخدام المنظف لمدة خمس دقائق. يتبع ذلك غسلتان قصيرتان بمحلول PBS. ثم قم بحجب العيون لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.