JoVE Encyclopedia of Experiments
علم الأحياء الدقيقة
0 مشاهدات • 2:24 د • August 31st, 2026
ابدأ بعين فأر معدل وراثياً تم حقنه مسبقاً بفيروس مرتبط بالغدة (AAV) يحمل الجين المستهدف الذي يشفر بروتيناً فلوروسنتياً.
يفتقر الفأر إلى جين ضروري للحفاظ على سلامة الغشاء المحدد الداخلي (ILM)، وهو حاجز يفصل الشبكية عن التجويف الزجاجي.
يؤدي فقدان هذا الجين إلى محاكاة التنكس الشبكي، مما يسمح للفيروس بالتغلغل بشكل أعمق في طبقات الخلايا الشبكية.
تُعبر الخلايا الشبكية المصابة عن الجين المستهدف، مما يؤدي إلى إنتاج بروتينات فلورية تسمح لها بالتفلور.
الآن، قم بتشريح العين وإزالة القرنية والعدسة.
افصل الشبكية بعناية عن الظهارة الصبغية للشبكية (RPE) والصلابة، وهي الطبقة الخارجية للعين.
اغمر النسيج في المثبت.
اغسل باستخدام المحلول المنظم الفوسفاتي لإزالة المثبت المتبقي.
عند الفحص باستخدام المجهر البؤري، يشير ظهور الفلورة في خلايا الشبكية إلى نجاح التغلغل الفيروسي عبر الغشاء المحدِّد الداخلي المتضرر.
بالنسبة للعينات المسطحة من الشبكية، يتم تسهيل عملية التشريح عن طريق تثبيت العيون المستأصلة في 4% paraformaldehyde لمدة تتراوح من 15 إلى 30 دقيقة. يجب إجراء عملية التثبيت هذه والتثبيت الذي يلي التشريح بشكل صحيح، حيث أن ذلك أمر بالغ الأهمية للحفاظ على فلورة GFP. وفي غضون 15 إلى 30 دقيقة من فترة التثبيت، يتم تشريح العيون وإزالة القرنية والعدسة.
افصل الشبكية عن الظهارة الصبغية للشبكية وعن الصلبة عن طريق القطع حول المسننة والعصب البصري. وبعد التشريح، اغمر الشبكية في 4% paraformaldehyde لمدة 30 دقيقة إضافية لتثبيت النسيج والبروتين الفلوري في خلايا الشبكية المنقولة. وبعد التثبيت، اغسل العينة لمدة خمس دقائق في PBS معقم عند pH 7.4.